Biophysical characterization of the N-terminal domain of Tetracenomycin ARO/CYC

Abstract

A tetracenomicina aromatase/ciclase (Tcm) é uma enzima presente em Streptomyces glaucescens envolvida na ciclização, aromatização e enovelamento de policetídeos. Os policetídeos são uma classe diversificada de metabólitos secundários produzidos por certos grupos de bactérias, fungos e plantas, com aplicações farmacêuticas. Exemplos incluem antibióticos, como a tetraciclina, e drogas anticâncer, como a doxorrubicina. O domínio N-terminal da Tcm (TcmN) participa de ciclizações específicas de policetídeos e é classificada como pertencente à superfamília Bet v 1. A TcmN catalisa a formação do primeiro (C9-C14) e segundo (C7-C16) anéis de policetídeos in vivo e in vitro. Este trabalho caracterizou a estabilidade e a diversidade conformacional da TcmN, informações importantes para o possível uso da TcmN em aplicações industriais, como na engenharia da biossíntese de policetídeos. A TcmN foi expressa em Escherichia coli BL21 (DE3) e purificada. Sua estrutura secundária e estabilidade foram avaliadas em diferentes condições de tampão por dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência. Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear foram adquiridos em espectrômetros de diferentes campos magnéticos (900, 800 e 600 MHz). 6 x 1 μs de simulações de Dinâmica Molecular da TcmN foram realizadas em solvente explícito. A desnaturação térmica da TcmN é irreversível e a temperatura de desnaturação é reduzida em concentrações mais altas da proteína. A TcmN é mais estável em torno de pH 8 e na presença de NaI e NaCl. Os resultados de ressonância magnética nuclear e de dinâmica molecular sugerem que a ligação do substrato e a liberação do produto podem ser moduladas pela flexibilidade de algumas alças. Juntos, os resultados apresentados neste trabalho sugerem que a TcmN existe em equilíbrio entre a conformação aberta, que favorece a ligação do ligante na cavidade hidrofóbica, e um principal estado fechado, que o protege a cavidade contra a exposição de solventes e à agregação.