Relação do perfil proteômico diferencial do plasma seminal de búfalos com a longevidade espermática pós descongelamento
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
Descrição
Tipo
Tese de doutorado
Título alternativo
Primeiro orientador
Membros da banca
Otávio Mitio Ohashi
Maria Isabel Vaz de Melo
Ivan Cunha Bustamante Filho
Gabriel Augusto Monteiro
Maria Isabel Vaz de Melo
Ivan Cunha Bustamante Filho
Gabriel Augusto Monteiro
Resumo
O objetivo do presente trabalho foi avaliar as diferenças no perfil proteômico do plasma seminal de
búfalos (Bubalus bubalis) relacionadas à resistência espermática ao processo de congelamentodescongelamento. Para tanto, um total de 118 ejaculados obtidos de 13 touros búfalo foram submetidos
ao processo de congelamento de espermatozoides. Previamente ao processamento, uma alíquota de cada
ejaculado foi centrifugada para recuperação do plasma seminal para posterior análise proteômica. A
resposta dos espermatozoides ao processo de congelamento-descongelamento foi avaliada a partir dos
parâmetros de motilidade e da cinética espermática, fornecidos pelo CASA (Computer Assisted Sperm
Analysis), nos tempos: imediatamente antes do resfriamento (PR), imediatamente antes do
congelamento (PC) e após o descongelamento nos tempos 5 (PD_T5), 60 (PD_T60), 120 (PD_T120) e
180 (PD_T180) minutos. As diferenças no perfil proteômico do plasma seminal foram avaliadas por
eletroforese diferencial (difference in-gel electrophoresis, DIGE). Para todas a análises, utilizou-se p ≤
0,05. Grande variação inter e intra-indivíduo foi observada na longevidade da motilidade espermática
após o descongelamento, sendo a maior variabilidade observada entre os ejaculados de um mesmo
animal. A partir do declínio da motilidade total entre os tempos PR e PD_T180, foram selecionados os
ejaculados que apresentaram maior (grupo de resistência espermática boa_RB, n = 21) e menor (grupo
de resistência espermática ruim_RR, n = 19) resistência espermática ao congelamentodescongelamento. Os ejaculados RB e RR foram semelhantes quanto às características espermáticas nas
avaliações anteriores ao congelamento, exceto para os parâmetros de velocidade (VCL, VSL, VAP), os
quais foram maiores no grupo RB (p ≤ 0,05). Imediatamente após o descongelamento e durante o
período de incubação, os ejaculados RB mantiveram maior velocidade (VCL, VSL, VAP), e
apresentaram maior motilidade total e porcentagem de células rápidas em todos os tempos de avaliação
(p ≤ 0,05). Após o descongelamento, principalmente ao final do período de incubação (120 e/ou 180
minutos), o grupo RB também apresentou maiores valores de ALH, STR, BCF e LIN (p ≤ 0,05). Nove
ejaculados RB e oito RR foram selecionados para a análise proteômica. Trinta e quatro spots foram
diferencialmente intensos nos pools de plasma seminal RBp e RRp, sendo 30 mais intensos no grupo
RBp e quatro no grupo RRp (p ≤ 0,05). Dentre os spots de maior intensidade no grupo RBp, 14
apresentaram peso molecular entre 33 e 41 kDa e ponto isoelétrico entre 4,2 e 4,9, respectivamente, e
representaram 41,2% do número total de spots diferencialmente intensos e 43,8% da intensidade relativa
total. Desses 14 spots, 12 foram identificados por espectrometria de massas em MALDI-TOF/TOF como
Clusterinas. Além disso, dentre os spots de maior intensidade no grupo RRp, foi identificada a proteína
14-3-3 zeta/delta. Concluiu-se que os ejaculados de búfalos apresentaram grande variação na resistência
espermática ao processo de congelamento-descongelamento, caracterizada por maior sobrevivência e,
principalmente, longevidade dos espermatozoides após o descongelamento. Por fim, diferenças no perfil
proteômico do plasma seminal foram observadas entre os ejaculados de maior e menor resistência
espermática, sendo a proteína clusterina mais abundante no plasma seminal dos ejaculados cujos
espermatozoides foram mais resistentes ao processo.
Abstract
This study aimed to evaluate proteomic profile of seminal plasma of buffaloes (Bubalus bubalis) related
to sperm resistance to the freezing-thawing process. Therefore, 118 ejaculates of 13 buffalo bulls were
submitted to sperm freezing process. Prior to processing, an aliquot of each ejaculate was centrifugated
and the seminal plasma recovered for posterior proteomic analyses. Sperm resistance to the freezingthawing process was evaluated through motility and kinetic parameters, provided by CASA (Computer
Assisted Sperm Analysis), at different moments: just before cooling (PR), just before freezing (PC) and
after thawing at five (PD_T5), 60 (PD_T60), 120 (PD_T120) and 180 (PD_T180) minutes. Differences
in proteomic profile were evaluated in difference in-gel electrophoresis (DIGE). For all analyses p ≤
0.05 was considered. Inter and intra-individual variations in post-thaw sperm longevity were observed
with the greatest variability presented between ejaculates from the same semen donor. Based on the
decline of the total motility between PR and PD_T180, the ejaculates that presented the highest (group
of high sperm resistance – HR, n = 21) and the lowest (group of low sperm resistance – LR, n = 19)
sperm resistance to freezing-thawing were selected. The HR and LR ejaculates presented similar sperm
characteristics before freezing, except for velocity parameters (VCL, VSL, VAP), which were higher in
the HR group (p ≤ 0.05). Just after thawing and during the post-thaw incubation period, the HR
ejaculates maintained higher velocity (VCL, VSL, VAP) and presented higher values of total motility
and rapid cells at all the evaluation times (p ≤ 0.05). After thawing, especially at the end of the incubation
period (120 and/or 180 minutes post-thaw), the HR group also presented higher values of ALH, STR,
BCF and LIN (p ≤ 0.05). Nine HR and eight LR ejaculates were selected to proteomic analysis. Thirtyfour spots showed differential intensity in HR and LR pools of seminal plasma, of which 30 were
presented in higher intensity in HR group and four in LR group (p ≤ 0.05). Among the spots with higher
intensity in HR group, 14 presented molecular weight between 33 and 41 kDa and isoelectric point of
4.2 to 4.9, respectively. These spots represented 41.2% of the total number of spots with differential
intensity and 43.8% of total relative intensity. Of those 14 spots, 12 were identified by MALDITOF/TOF mass spectrometry as Clusterins. Furthermore, 14-3-3 zeta/delta protein was identified as
more abundant in LR group. It was concluded that buffalo ejaculates had great variability in sperm
resistance to the freezing-thawing process, which was characterized by higher post-thaw sperm survival
and specially longevity. Furthermore, HR e LR ejaculates presented differences in proteomic profile of
seminal plasma with higher abundance of Clusterin in the seminal plasma of HR ejaculates.
Assunto
Reprodução animal
Palavras-chave
Bufalo, Sêmen, Reprodução animal