Estudo de repertório sorológico de anticorpos de cavalo contra veneno de aranhas do gênero Loxosceles de importância médica no Brasil
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Tipo
Dissertação de mestrado
Título alternativo
"STUDY OF SEROLOGICAL REPERTOIRE OF HORSE ANTIBODIES AGAINST THE VENOM OF LOXOSCELES SPIDERS OF MEDICAL IMPORTANCE IN BRAZIL
Primeiro orientador
Membros da banca
Alexandre Keiji Tashima
Mariana Torquato Quezado de Magalhães
Mariana Torquato Quezado de Magalhães
Resumo
Os acidentes com aranhas do gênero Loxosceles (ou aranhas-marrom) têm incidência
crescente no Brasil e podem desencadear lesões dermonecróticas severas, falência renal e
óbito. A soroterapia é o único tratamento específico à disposição e consiste em frações de
anticorpos de cavalos hiperimunizados com o veneno das aranhas. O uso dessa terapia pode
gerar reações adversas e sua produção depende da extração do veneno das aranhas para
imunização dos equinos com moléculas tóxicas que impactam na sobrevida desses animais.
Diversas tentativas têm sido exploradas para contornar essas limitações, mas o
desconhecimento das características de anticorpos de cavalo limita a busca por novas
soluções. Neste trabalho, o repertório de anticorpos sorológico de quatro cavalos
hiperimunizados com veneno de L. intermedia, L. gaucho e L. laeta foi caracterizado quanto
as classes e subclasses de imunoglobulinas e quanto as sequências dos anticorpos que o
compõe. Plasmas equinos antes e após hiperimunização foram usados para quantificação
das classes de imunoglobulinas e subclasses de IgG e em sequência para isolamento de IgG,
obtenção de F(ab’)2, seleção de F(ab’)2 específicas contra pool de venenos das três espécies
ou contra o principal componente do veneno, a fosfolipase D e digestão por tripsina. Os
peptídeos trípticos de F(ab’)2 específicas foram analisados por LC-MS/MS e mapeados às
sequências de cadeia pesada imunoglobulina do transcriptoma de PBMCs de cada animal,
utilizando o CDRH3 como parâmetro para identificação. Quanto as classes de
imunoglobulinas, foram encontradas concentração mediana de IgM de 0,63 e de IgG de
241,42 mg/mL nos plasmas hiperimunes. Antes do isolamento com proteína G, a subclasse
IgG(T) foi encontrada com maior abundância nos plasmas e após o isolamento nota-se
predomínio de IgGb. A partir dos dados de LC-MS/MS, foram identificadas 132 sequências da
região variável da cadeia pesada específicas contra o pool de venenos, 19 contra rLiD1 e 12
sequências foram identificadas com as duas especificidades. Nessas sequências, os
segmentos gênicos IGHV4-29, IGHD2-26 e IGHJ6 foram mais utilizados, os CDRH3
apresentaram maior frequência de resíduos carregados (Asp e Arg) em comparação ao
repertório inespecífico e tinham comprimento mediano de 17 aminoácidos. O cálculo da
abundância a partir da área sob a curva dos peptídeos revelou uma reposta polarizada com
mais de 80% da abundância concentrada nos top 3 e top 5 clones de imunoglobulinas
específicos contra o pool de venenos e rLiD1, respectivamente. A predição de paratopos
destes anticorpos contra rLiD1 indica alta convergência, com quatro possíveis epítopos
reconhecidos pelas 31 sequências. Pelo nosso conhecimento, esse é o primeiro trabalho a
utilizar o Ig-Seq na caracterização de anticorpos equinos. A descoberta de sequências da
região variável da cadeia pesada de imunoglobulinas e suas características podem ser
aplicadas na produção e otimização de anticorpos sintéticos para uso terapêutico
Abstract
The accidents caused by spiders of the Loxosceles genus (also called brown-spiders)
are rising in incidence in Brazil and may cause severe dermonecrotic lesions, renal failure and
death. Serotherapy is the only specific treatment available and is based on antibodies from
horses hyperimmunized with the spiders’ venom. The use of this therapy may cause adverse
reactions and its production relies on the extraction of the venom from the spiders for the
immunization of the horses, a process that impacts negatively on the life of the inoculated
animals. Many attempts to overcome these limitations have been explored, but the lack of
knowledge about the characteristics of horses’ immunoglobulins limits the search for new
solutions. In this work, the repertoire of serological antibodies of four horses hyperimmunized
with venom from L. intermedia, L. gaucho and L. laeta was characterized relative to its classes
and subclasses and to the sequences that compose them. Equine plasmas collected before
and after the immunization were used for the quantification of immunoglobulin classes and IgG
subclasses and, after that, for isolation of IgG, obtention of F(ab’)2, selection of F(ab’)2 fractions
specific against the pool of venoms or against rLiD1 and trypsin digestion. Specific F(ab')2
tryptic peptides were analyzed by LC-MS/MS and mapped to the immunoglobulin heavy chain
sequences of the transcriptome of PBMCs of each animal, using CDRH3 as a parameter for
identification. As for the immunoglobulin classes, a median concentration of 0.63 for IgM and
of 241.42 mg/mL for IgG were found in hyperimmune plasmas. Before isolation using protein
G, the IgG(T) subclass was found with greater abundance in plasmas and after isolation, IgGb
predominated. From the LC-MS/MS data, 132 heavy chain variable region sequences specific
against the pool of venoms were identified, as well as 19 against rLiD1 and 12 with both
specificities. In these sequences, the IGHV4-29, IGHD2-26 and IGHJ6 gene segments were
more used, the CDRH3 had a higher frequency of charged residues (Asp and Arg) compared
to the nonspecific repertoire and had a median length of 17 amino acids. Calculation of
abundance from the area under the curve of the peptides revealed a polarized response with
more than 80% of the abundance concentrated in the top 3 and top 5 clones of specific
immunoglobulins against the pool of venoms and rLiD1, respectively. The prediction of
paratopes against rLiD1 indicates high convergence, with four possible epitopes recognized
by the 31 sequences. To our knowledge, this is the first work to use Ig-Seq for the
characterization of equine antibodies. The discovery of sequences of the variable region of the
heavy chain of immunoglobulins and its characteristics may be useful in the production and
optimization of synthetic antibodies designed for therapeutical applications.
Assunto
Bioquímica e Imunologia, Cavalos, Imunoglobulinas, Venenos de Aranha
Palavras-chave
Imunoglobulinas, Cavalos, Veneno, Proteômica, Loxosceles