Comparison of Four Methods of RNA Extraction and cDNA Synthesis from The Venom of Peruvian Snakes of the Genus Bothrops of Clinical Importance
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Comparação de quatro métodos de extração de RNA e síntese de cDNA a partir do veneno de serpentes peruanas do gênero Bothrops de importância clínica
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Resumo
A purificação de RNA e a síntese de cDNA representam o ponto de partida para análises moleculares de proteínas-enzimas do veneno de serpentes. Normalmente, o sacrifício das serpentes é necessário para a extração da glândula de veneno, visando a identificação de transcritos codificadores de proteínas; entretanto, o veneno pode ser utilizado como fonte de transcritos. Embora existam métodos para a obtenção de RNA a partir do veneno, nenhuma análise comparativa foi realizada no gênero Bothrops . No presente estudo, comparamos quatro métodos comerciais para purificação de RNA e síntese de cDNA a partir do veneno (líquido, liofilizado ou armazenado a longo prazo) de quatro espécies clinicamente relevantes de Bothrops peruanas . Nossos resultados mostram que o método TRIzol apresenta o maior rendimento de RNA purificado a partir do veneno (59 ± 11 ng/100 µL ou 10 mg). O kit SuperScript First-Strand Synthesis System produziu altas quantidades de cDNA (3,2 ± 1,2 ng de cDNA/ng de RNA), sendo o maior valor obtido com a combinação com o kit Dynabeads mRNA DIRECT (4,8 ± 2,0 ng de cDNA/ng de RNA). A utilidade do cDNA foi demonstrada com a amplificação de seis toxinas relevantes: enzimas semelhantes à trombina, metaloproteinases PI e P-III, fosfolipases A2 ácidas e básicas e disintegrinas. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo comparativo de metodologias de purificação de RNA e síntese de cDNA a partir do veneno do gênero Bothrops .
Abstract
RNA purification and cDNA synthesis represents the starting point for molecular analyses of snake venom proteins-enzymes. Usually, the sacrifice of snakes is necessary for venom gland extraction to identify protein-coding transcripts; however, the venom can be used as a source of transcripts. Although there are methods for obtaining RNA from venom, no comparative analysis has been conducted in the Bothrops genus. In the present study, we compared four commercial methods for RNA purification and cDNA synthesis from venom (liquid, lyophilized, or long-term storage) of four clinically relevant species of Peruvian Bothrops. Our results show that the TRIzol method presents the highest yield of RNA purified from venom (59 ± 11 ng/100 µL or 10 mg). The SuperScript First-Strand Synthesis System kit produced high amounts of cDNA (3.2 ± 1.2 ng cDNA/ng RNA), and the highest value was from combination with the Dynabeads mRNA DIRECT kit (4.8 ± 2.0 ng cDNA/ng RNA). The utility of cDNA was demonstrated with the amplification of six relevant toxins: thrombin-like enzymes, P-I and P-III metalloproteinases, acid and basic phospholipases A2, and disintegrins. To our knowledge, this is the first comparative study of RNA purification and cDNA synthesis methodologies from Bothrops genus venom.
Assunto
Elapidae, Peru
Palavras-chave
Bothrops, Venom, RNA purification, cDNA synthesis, Venom gland, Transcripts
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https://www.mdpi.com/1422-0067/24/13/11161