Caracterização parcial e localização subcelular de um fator de troca de nucleotídeos guanina associado à proteína Ras (RasGEF1b) induzido por agonistas de receptores do tipo Toll
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Dissertação de mestrado
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Resumo
Os fatores de troca de nucleotídeos guanina da proteína Ras (RasGEFs) são componentes celulares essenciais no processo de ativação das RasGTPases em resposta a diversos estímulosextracelulares. O rasGEF1b é um fator de troca de nucleotídeos guanina (GEF) altamente conservado. A expressão do RNAm do rasGEF1b em macrófagos é induzida por diferentes agonistas de receptores do tipo Toll (TLRs), tais como LPS (TLR4), GPI-mucin (TLR2) e Poli I:C (TLR3). A predição da provável localização subcelular da proteína RasGEF1b foi realizada inicialmente por meio de análises de bioinformática. A expressão da proteína recombinante em células HEK 293T transfectadas com o plasmídio pFLAGCMV2-RasGEF1b, e análise por Western Blotting utilizando anticorpo monoclonal anti-FLAG, demonstrou uma proteína de massa molecular aparente de 56kDa. Pela técnica de centrifugação diferencial, células HEK 293T foram fracionadas e as diferentes frações foram marcadas com anticorpos monoclonais específicos, dirigidos contra proteínas das mesmas; utilizando esta metodologia, demonstramos que a proteína FLAGRasGEF1b está presente em maior abundância nas frações de núcleo e membranas pesadas. O DNA do FLAGRasGEF1b foi inserido em um plasmídio em fusão com as proteínas fluorescentes mRFP ou YFP, e por microscopia confocal demonstramos a localização da proteína em endossomos primários e endolisossomos. Pela técnica de RNA de interferência (RNAi), inibimos a expressão da proteína recombinante FLAGRasGEF1b-YFP. Além disso, demonstramos que RasGEF1B é capaz de atuar como fator de troca de guaninas de Ras quando expressa em células HEK 293T in vitro.
Abstract
The guanine nucleotide exchange factors of the Ras protein super family (RasGEFs) are essential cellular components in the process of Ras activation in response to diverse extra cellular stimuli. The rasGEF1b is a highly conserved guanine exchange factor (GEF). In macrophagesexpression of rasGEF1b mRNA is induced by different TLRs agonists, such as LPS (TLR4), GPImucin (TLR2) and Poli I: C (TLR3). First, by using bioinformatics tolls we analyzed the probable RasGEF1b subcellular localization. The pFLAGCMV2 encoding the recombinant protein FLAGRasGEF1b was used to transfect HEK 293T cells and protein expression evaluated by Western Blot using an anti-FLAG mAb, it showed a protein with apparent molecular weight of 56kDa. By using differential centrifugation, HEK 293T cells were fractioned and the different fractions were recognized using monoclonal antibodies specific to protein of them, using this methodology, we showed that the protein FLAGRasGEF1b was present mostly in the nuclear and heavy membrane fractions. The FLAGRasGEF1b was inserted into a plasmid in fusion with mRFP or YFP fluorescent proteins, and by using confocal microscopy we showed that the proteins were present at early endosome and endolysosome. By using RNA interference (RNAi) we inhibit the expression of FLAGRasGEF1b-YFP, which was capable to activate Ras in HEK 293T cells in vitro.
Assunto
Bioquímica, Fatores ras de troca de nucleotídeo guanina, Nucleotidios
Palavras-chave
Bioquímica e Imunologia