Seleção de colônias de Clostridium perfringens tipo D produtoras de toxina épsilon por "dot blot"
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Dissertação de mestrado
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Resumo
Para seleção de amostras de Clostridium perfringens tipo D produtoras de toxina épsilon, padronizou-se o teste de dot blot com toxina épsilon adsorvida em membrana de nitrocelulose, anti-toxina épsilon, produzida em carneiro e anti-imunoglobulina de carneiro,produzida em coelho, marcada com peroxidase. A reação foi revelada utilizando-se Kit Substrato DAB 3,3 diaminobenzidina, e a leitura foi feita visualmente de acordo com a intensidade de cor obtida em cada poço. Foram selecionados clones produtores de toxina épsilon obtidos de unidades formadoras de colônias e, após três passagens, obteve-se títulos em dose mínima mortal (DMM) determinado em camundongos, 1000 vezes superiores aos obtidos com a amostra original. A presença do gene etx que codifica a síntese da toxina épsilon foi verificada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e todos os clones foram positivos, mesmo aqueles negativos ao dot blot. O teste de dot blot mostrou-se eficiente para selecionar colônias toxigênicas de C. perfringens tipo D.
Abstract
In order to select strains of Clostridium perfringens type D producers for epsilon toxin, a dot blot was standardized test using epsilon toxin adsorbed in nitrocellulose membrane, anti-epsilon toxin produced in sheep and anti-immunoglobulin of sheep produced in rabbit conjugated with peroxidase. The reaction was visualized using DAB Substrate Kit 3,3 diaminobenzidine and the reading was made according to the intensity of color obtained in each well. Clones producing epsilon toxin were selected by limiting dilution and after three passages, mortal minimum dose (MMD) titres were determined in mice. Selected clones produced epsilon toxin 1000 times more concentrated those the original strain. The presence of the gene etx that encodes the synthesis of the epsilon toxin was verified by the polymerase chain reaction, and all clones were positive, including those negative at the dot blot. It was concluded that the dot blot test was efficient for selecting toxigenic colonies of C. perfringens type D.
Assunto
Clostridium Toxinas, Clostridium perfringens
Palavras-chave
Gene etx, Toxina épsilon, Clostridium perfringens, "dot blot", PCR