Clinical and biophysical characterization of a mutation in the n-helix region of cardiac troponin c: evidence for an allosteric mechanism of contractile dysfunction

Abstract

A troponina é uma proteína heterotrimérica, de ligação ao Ca2+, responsável pela regulação da contração muscular no coração. Mutações sem sentido em genes que codificam as subunidades do complexo de troponina cardíaca estão associadas à cardiomiopatia de dilatação hereditária (CMD). No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes da patogênese da doença não são totalmente compreendidos. Aqui, relatamos um caso clínico de uma menina de 1 ano que apresentou CMD grave e hipotonia. O sequenciamento completo do exoma revelou uma variante heterozigótica de novo não relatada anteriormente no exon 1 do gene TNNC1 (c.12C>G), resultando em uma mutação Ile4Met localizada na região N-Helix da troponina C cardíaca (cTnC). Utilizamos várias técnicas biofísicas e bioquímicas para examinar a base molecular desta variante patogênica e fornecer evidências de comunicação alostérica dentro da subunidade de ligação ao Ca2+ do complexo troponina. A extração in vitro de cTnC nativo e a reconstituição com WT recombinante ou I4M cTnC em preparações de músculo cardíaco revelaram diminuição da sensibilidade ao Ca2+ de desenvolvimento de força isométrica e cinética mais lenta de redesenvolvimento de tensão (ktr) para I4M em comparação com WT cTnC. Medições de fluorescência de estado estacionário em cTnC isolado usando Bis-ANS indicaram ligação aumentada de Ca2+ no domínio C-terminal de I4M em comparação com WT. Além disso, cTnC-I4M exibiu uma magnitude menor de exposição hidrofóbica induzida por Ca2+ em comparação com WT. Finalmente, os estudos de titulação de fluorescência IANBD (marcados individualmente em cisteína 84) revelaram uma ligação mais forte de TnI cardíaco a I4M em comparação com WT. Em conjunto, esses resultados sugerem que a cinética contrátil perturbada e a ligação alterada de Ca2+, talvez por um mecanismo alostérico, provavelmente contribuem para a disfunção contrátil observada neste probando. Experimentos usando espectroscopia de RMN de solução estão atualmente em andamento para determinar como uma mutação patogênica na N-hélice afeta a estrutura geral e a dinâmica de cTnC. NIH-HL128683.