Diagnóstico laboratorial da doença hemorrágica epizoótica em cervídeos brasileiros
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Dissertação de mestrado
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Michelle de Paula Gabardo, Érica Azevedo Costa
Resumo
Entre as principais causas de mortalidade em cervídeos estão as doenças hemorrágicas, que contribuem para o estado de perigo de extinção de algumas espécies de cervos. Entre elas, o vírus da doença hemorrágica epizoótica (EHDV) e o vírus da língua azul (BTV) causam perdas significativas nas populações de cervídeos brasileiros em cativeiro. O objetivo deste estudo foi padronizar e avaliar as técnicas de imunofluorescência, imuno-histoquímica e qRT-PCR para detecção do EHDV em culturas de células ou em tecidos parafinizados de cervídeos brasileiros que vieram a óbito devido à doença hemorrágica. Foi produzido soro hiperimune em duas coelhas a partir de quatro inoculações com EHDV sorotipo 2 (EHDV-2). Os soros dos animais foram testados pelo método de imunodifusão em gel de ágar (IDGA) e soroneutralização até atingirem o título de anticorpos desejados. Foram coletados fragmentos de vários órgãos de nove cervos que morreram com doença hemorrágica aguda em 2017. A infecção por EHDV foi confirmada, pela técnica de qRT-PCR, em seis animais, um Blastocerus dichotomus e cinco Mazama nana. Em seguida, os fragmentos de tecidos dos cervos positivos foram processados para análise histopatológica. Posteriormente, o soro hiperimine produzido foi purificado e utilizado para padronização da imuno-histoquímica (IHQ) utilizando a técnica da Streptavidina conjugada. Os órgãos utilizados para essa técnica foram baço, pulmão, linfonodo, fígado, rim e testículos. Os mesmos anticorpos foram bioconjugados com pontos quânticos (QDs) e utilizados no teste de imunofluorescência direta em cultura de células infectadas com EHDV-2. Os tecidos parafinizados foram submetidos a dois métodos de extração de matérial genético e, em seguida, foi realizado o qRT-PCR das amostras. Na avaliação histopatológica, as principais alterações observadas foram hiperemia, hemorragia, edema e infiltrado inflamatório, predominantemente linfoplasmocitário agudo. Utilizando o teste de IHQ padronizado foi possível detectar EHDV nos tecidos estudados, sendo que em linfócitos, macrófagos e células endoteliais e epiteliais foi observada a maior intensidade de imunomarcação. A imunofluorescência direta utilizando os QDs também foi eficaz na identificação de células infectadas com vírus. Com relação aos protocolos de extração de RNA, ambos apresentaram valores de Ct que variaram de 36 a 39, nas amostras positivas sendo, portanto, superiores aos encontrados quando o material genético foi extraído dos mesmos tecidos frescos e onde foram registrados CTs menores de 30. Assim, na padronização e avaliação das técnicas de diagnóstico, a IHQ demonstrou ser uma técnica eficiente para detecção do vírus em tecidos parafinizados, sendo importante em estudos retrospectivos e de patogenia da doença hemorrágica epizoótica. A imunofluorescência direta utilizando os QDs é uma alternativa promissora no diagnóstico da infecção por EHDV. Os protocolos de extração de RNA em material parafinado, na maioria das amostraS, demonstraram resultados inferiores no tecido fresco, provavelmente em consequência à degradação do ácido nucleico que ocorre devido à etapa de fixação em formol, compromentendo, portanto, os resultados da qRT-PCR.
Abstract
Among the main causes of mortality in cervids is hemorrhagic disease, which contributes to the endangered state of some deer species. Among them, epizootic haemorrhagic disease virus (EHDV) and bluetongue virus (BTV) have caused significant losses in Brazilian cervid populations. The objective of this study was to standardize and implement the immunofluorescence, immunohistochemistry and qRT-PCR techniques for detection of EHDV in cell cultures or paraffin tissues of Brazilian cervids that died with hemorrhagic disease. Hyperimmune serum was produced in two rabbits after four inoculations with EHDV serotype 2 (EHDV-2). The sera of the animals were tested by agar gel immunodiffusion (IDGA) and serum neutralization until they reached the desired antibody titre. Fragments of several organs of nine deer that died with acute hemorrhagic disease in 2017 were collected. The EHDV infection was confirmed by the qRT-PCR technique in six animals, one Blastocerus dichotomus and five Mazama nana. Then, tissue fragments from positive deer were processed for histopathological analysis. Subsequently, hyperimine serum produced was purified and used to standardize the immunohistochemistry (IHC) using Streptavidin conjugated technique. The organs used for this technique were spleen, lung, lymph node, liver, kidney and testicle. The same antibodies were bioconjugated with quantum dots (QDs) and used in a direct immunofluorescence technique in culture of cells infected with EHDV-2. The paraffinized tissues were subjected to two methods of extraction of genetic material and then performed the qRT-PCR of the samples was performed. In the histopathological evaluation, the main alterations observed were hyperemia, hemorrhage, edema and inflammatory infiltrate, predominantly acute lymphoplasmocytary. Using the standardized IHQ test, it was possible detect EHDV in the studied tissues, with lymphocytes, macrophages, endothelial and epithelial cells being observed to be more immunostaining. Direct immunofluorescence using the QDs was also effective in identifying viral infected cells. In relation to the RNA extraction protocols, both presented Ct values that ranged from 36 to 39, in the positive samples, therefore being higher than those found when the genetic material was extracte from the same fresh tissues and where CTs under 30 were recorded. Thus, in the standardization and implementation of the diagnosis techniques, IHC has been shown to be an efficient technique for detecting the virus in paraffin-embedded tissues, being important in further retrospective and pathogenesis studies of epizootic haemorrhagic disease. Direct immunofluorescence using QDs is a promising alternative in the diagnosis of EHDV infection. The RNA extraction protocols in paraffin, in most samples, demonstrated inferior results in fresh tissue, probably as a result of degradation of nucleic acid that occurs due to the formaldehyde fixation step, thus compromising the results of the qRT-PCR.
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Cervídeo Doenças, Medicina Veterinária
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