Prospecção dos inibidores de fosfolipases A2 das classes alfa e gama (PLI e PLI) endógenos no plasma de serpentes Crotalidae brasileiras: caracterização molecular e propriedades biológicas
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
Descrição
Tipo
Tese de doutorado
Título alternativo
Primeiro orientador
Membros da banca
Jonas Enrique Aguilar Perales
Marta do Nascimento Cordeiro
Maria Elena de Lima Perez Garcia
Carlos Renato Machado
Marta do Nascimento Cordeiro
Maria Elena de Lima Perez Garcia
Carlos Renato Machado
Resumo
A presença de inibidores plasmáticos de fosfolipase A2 (PLA2) no plasma de serpentes tem sido relatada por vários pesquisadores. Estes inibidores atualmente são classificados em três classes: alfa, beta e gama, de acordo com sua estrutura (Ohkura e cols., 1997). Inibidores alfa apresentam domínios semelhantes ao domínio de reconhecimento de carboidratos (CRD) das lectinas tipo-C, enquanto inibidores da classe gama apresentam em sua estrutura, repetições ricas em leucina (LRR), como a 2-macroglobulna humana. Já a classe gama mostram um padrão de resíduos cisteína similar ao do receptor do ativador de plasminogênio tipo uroquinase (u-PAR). Neste trabalho investigamos a presença de cDNAs codificadores de inibidores de PLA2 (PLIs) das classes alfa e gama no fígado de seis espécies de serpentes do gênero Bothrops (B. alternatus, B. erythromelas, B. jararaca, B. jararacussu, B. moojeni e B. neuwiedi), além de Lachesis muta muta e Crotalus durissus terrificus. Os cDNAs foram obtidos por RT-PCR a partir do RNA total do fígado de cada espécime. A amplificação do DNA foi realizada por PCR na presença de oligonucleotídeos desenhados com base na sequência de nucleotídeos publicados na literatura (inibidor alfa de Agkistrodon blomhoffii siniticus e no inibidor gama de C. d. terrificus). Os produtos de amplificação foram clonados em vetores do tipo TA e colônias recombinantes positivas foram confirmadas por PCR. Os DNAs de pelo menos quatro clones positivos para cada inibidor alfa e dois clones para cada inibidor gama foram completamente sequenciados. As sequências nucleotídicas, assim como as estruturas primárias deduzidas foram alinhados com sequências de inibidores conhecidos para pesquisa de homologia. Utilizando ferramentas de bioinformática foram realizadas análises detalhadas para cada proteína. Foram derivadas árvores filogenéticas para cada classe de PLIs brasileiros descritos, assim como a sugestão de modelos tridimensionais. A expressão de uma proteína recombinante da classe alfa foi realizada com sucesso em sistema de expressão procariota.
Abstract
The presence of phospholipase A2 (PLA2) inhibitors in the blood plasma of snakes has been reported by several authors. These inhibitors are, presently, classified in three structural classes named alfa, beta and gamma. Alfa-inhibitors contain a domain similar to the carbohydrate recognition domain (CRD) of C-type lectins, whereas beta-inhibitors display leucine-rich repeats (LRR) such as those present in the human alpha2- macroglobulin. In the gamma-class members, in turn, the cystein pattern resembles that found in the uroquinase-type plasminogen activator receptor (u-PAR). In the present study we investigated the presence of mRNA codifying for alfa- and gamma-PLA2 inhibitors (PLIs) in the liver tissue of of six Brazilian snake species in the genus Bothrops (B. alternatus, B. erythromelas, B. jararaca, B. jararacussu, B. moojeni and B. neuwiedi) besides Lachesis muta and Crotalus durissus terrificus, by RT-PCR. DNA amplification was performed in the presence of primers designed based on PLIs already published in the literature (an alpha-PLI from Agkistrodon blomhoffii siniticus and a gamma-PLI from C. d. terrificus). The amplification products were cloned in TA-kind plasmid vector and a number of putative positive clones was confirmed by PCR. The DNAs of a minimum of four and two positive clones for alfa- and gamma- PLIs, respectively, were completely sequenced. The nucleotide sequences as well as the deduced primary sequences obtained were aligned with known PLIs looking for homology. A detailed analysis of each novel PLI-homologous protein was performed using bioinformatics tools. Phylogenetic trees were derived for the alpha- and gamma-PLIs from Brazilian snakes described, so far, and the tridimensional structure of an alpha-PLI (from L. muta) was modelled by homology. The obtention of a representative recombinant protein alpha-PLI (in procariote) are described.
Assunto
Bioquímica, Serpentes, Fosfolipase A2 Inibidores, Cobra Veneno, Inibidores enzimáticos
Palavras-chave
Bioquímica e imunologia