Produção de biossurfactantes/bioemulsificantes por leveduras isoladas de efluentes de uma indústria de laticínios
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Tese de doutorado
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Resumo
Novas linhagens de leveduras produtoras de biossurfactantes foram isoladas a
partir de uma planta de tratamento de efluentes de uma indústria de laticínios. Estas
linhagens foram identificadas como pertencentes ao gênero Trichosporon,
Galactomyces, Geotrichum e Candida baseada na sequências da região D1/D2 do
rDNA e TS1 e ITS2 do 26S do rDNA. Entre as 32 linhagens de leveduras produtoras
de emulsificantes, 13 mostraram atividade emulsificante (E24) após 2 meses de
incubação. As emulsões formadas se mantiveram estáveis por até 2 meses de
incubação, com valores de atividade emulsificante (E24) variando de 7,32% para
78,52%. As maiores taxas de atividade emulsificante foram observadas em
emulsões produzidas a partir das culturas de Trichosporon loubieri CLV 20,
Geothricum sp. CLOA 40, T. montevideense CLOA 70 e T. montevideense CLOA
72, com valores de E24 em torno de 71,29%, 77,45%, 65,80% e 78,52%,
respectivamente. Estas linhagens reduziram a tensão superficial do meio de
crescimento com valores que variaram de 40,85 mN/m a 52 mN/m. Os surfactantes
apresentam diferentes tipos de ácidos graxos, com uma prevalência de ácidos
graxos contendo 18 carbonos (39,56% a 85,77% do conteúdo total). As análises
dos monossacarídeos presentes nos surfactantes indicaram a prevalência de xilose
para os biossurfactantes produzidos por CLV20 e CLOA70, manose para
biossurfactante produzido por CLOA72 e galactose para biossurfactante produzido
por CLOA40. A atividade emulsificante foi dependente da fonte de carbono no meio
de cultura, com maior atividade observada quando óleo de girassol e glicose foram
utilizados no meio de crescimento de CLOA72. A atividade emulsificante do
biossurfactante apresentou valores acima de 70% nas concentrações de 3 mg/mL a
3,5 mg/mL, e uma atividade superior a 75% em concentrações acima de 4,5 mg/mL.
A atividade emulsificante foi estável em uma ampla faixa de pH (2-10), e depois do
tratamento térmico a 100 °C. A atividade emulsificante foi igualmente estável após a
adição de 30% dos sais NaCl, KCl e NaHCO3. O biossurfactante foi capaz de
emulsificar diferentes substratos hidrofóbicos. A concentração micelar crítica foi
estimada em 2,2 mg/mL, indicando uma tensão superficial da água de 48,4 mN/m.Este estudo também, avaliou o efeito do biossurfactante produzido por T.
montevideense CLOA72 na formação de biofilmes da linhagem de Candida albicans
CC isolada de canal apical. A maior redução (87,41%) na formação de biofilmes foi
observadas na concentração de 16 mg/mL do biossurfactante. A interação de
células de C. albicans CC com biossurfactante foi caracterizada por titulação
calorimétrica isotérmica e potencial zeta. O processo de saturação das células de C.
albicans pela adição de 1,3 mg/mL/OD600. é endotérmico (H
o
= +1284 5,1
Cal/mg.DO600) ocorrendo com um elevado aumento de entropia (TS
o
= +10635,0
Cal/mg.DO600). A taxa de energia calórica liberada a partir da concentração mínima
de saturação sofreu uma brusca diminuição, indicando uma saturação do sistema
células-biossurfactante. O potencial zeta da superfície celular foi monitorado como
uma função da concentração do biossurfactante adicionado à suspensão celular. Os
dados sugerem que cargas líquidas de superfície das células são parcialmente
neutras, uma vez que o valor do potencial zeta variou entre -16 mV a - 6 mV
durante a titulação. Estas alterações da superfície podem contribuir para a inibição
da adesão inicial de células de C. albicans CC em superfície hidrofóbicas. O
biossurfactante produzido por T. montevideense CLOA72 não teve qualquer efeito
citotóxico em células embrionárias de rim humano HEK 293A nas concentrações de
0,25 a 1 mg/mL. O tratamento com o biossurfactante (CLOA72) reduziu a aderência
de C. albicans 18 em células bucais em 85,2%. Este estudo sugere uma possível
aplicação de biossurfactante produzido por T. montevideense CLOA72 na inibição
da formação de biofilmes sobre superfícies plásticas e inibição da aderência a
superfícies biológicas (células do hospedeiro) por linhagens de C. albicans.
Abstract
New strains of biosurfactants producing yeast were isolated from a sewage
treatment plant of a dairy product industry. These strains were identified as
belonging to the genus Trichosporon, Galactomyces, Geotrichum and Candida
based on the sequences of the D1/D2 region of 26S rDNA and ITS1-ITS2 from the
rDNA gene. Among the 32 yeast isolated, 13 showed emulsifying activity (E24) after
2 months of incubation. The emulsified solution remained stable for up to 2 months
of incubation, with values ranging from 7.32% to 78.52%. The highest emulsification
rates were observed in emulsions produced by supernatant cultures of Trichosporon
loubieri CLV 20, Geothricum sp. CLOA 40, T. montevideense CLOA 70 and T.
montevideense CLOA 72, with values of E24 to 71.29%, 77.45%, 65.80% and
78.52%, respectively. These strains reduced the surface tension of the growth
medium to values that ranged from 40.85 mN/m to 52 mN/m. The surfactants
contained different types of fatty acids, with a prevalence of molecules containing 18
carbons (39.56% to 85.77% of the total solution content). The analysis of
monosaccharides present in the surfactants indicated the prevalence of xylose for
biosurfactants produced by CLV20 and CLOA70, manose for biosurfactant produced
by CLOA72 and galactose for biosurfactant produced by CLOA40. The emulsifying
activity was dependent on the carbon source in the culture medium, with higher
activity observed when sunflower oil and glucose were used. The emulsifying activity
of the biosurfactant presented values above 70% at concentrations of 3 mg/mL to
3.5 mg/mL, and above 75% at concentrations above 4.5 mg/mL. The emulsifying
activity was stable in a wide range of pH (2-10), and after heat treatment at 100 °C.
The emulsifying activity was also stable after the addition of 30% of the salts NaCl,
KCl and NaHCO3. The biosurfactant was able to emulsify a wide range of
hydrophobic substrates. The critical micellar concentration estimated was in 2.2
mg/mL, giving a surface tension of water of 48.4 mN/m. This study also, evaluated
the effect of yeast biosurfactant T. montevideense CLOA72 in the formation of
biofilms by Candida albicans CC isolated from apical tooth canal. The greatest
reduction (87.41%) in the formation of biofilms were observed at a concentration of
16 mg/mL. The interaction of cells of C. albicans CC with biosurfactant characterized
was by isothermal titration calorimetry and zeta potential. The process of saturation of the cells of C. albicans by the addition of 1.3 to 5.1 is endhotermic ((Ho
= +1284
5.1 Cal/mg.OD600.) occurring with a high increase of entropy (S
o
= +10635,0
Cal/mg.OD600). The rate of caloric energy released from the minimum concentration
of saturation has decreased sharply, indicating a saturation of the cell-biosurfactant.
The rate of caloric energy released from the minimum inhibitory concentration
decreased sharply, indicating cell saturation by the biosurfactant. The zeta potential
of the cell surface were monitored as a function of the concentration of the
biosurfactant added to cell suspension. The data suggest that the net surface
charges of the cells is partialy neutral, since the value of zeta potential ranging
between -16 mV to - 6 mV during the titration. These changes of the surface can
contribute to the inhibition of initial adherence of cells of C. albicans in hydrophobic
surface. The biosurfactant produced by T. montevideense CLOA72 did not have any
cytotoxic effect in HEK 293A cell line at the concentrations of 0.25 to 1 mg/mL. The
treatment with the biossurfactant CLOA72 reduced the adhesion of C. albicans 18 to
buccal cells in 85.2%. This study suggests a possible application of biosurfactant
produced by T. montevideense CLOA72 in inhibiting the formation of biofilms on
plastic surfaces and inhibition of adherence to biological surfaces (cells of the host)
by strains of C. albicans.
Assunto
Microbiologia, Tensoativos, Emulsificantes, Indústria de Laticínios
Palavras-chave
Biossurfactantes, Indústria de laticínios, Surfactantes, Emulsificante