Desenvolvimento de ELISA indireto para detecção da infecção por Francisella orientalis e avaliação da eficiência vacinal contra Streptococcus agalactiae em tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus L.)
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
Descrição
Tipo
Tese de doutorado
Título alternativo
Primeiro orientador
Membros da banca
Jenner Karlisson Pimenta Reis
Rodrigo Otávio Silveira Silva
Marcia Pimenta Leibowitz
Marina Karina de Veiga Cabral Delphino
Rodrigo Otávio Silveira Silva
Marcia Pimenta Leibowitz
Marina Karina de Veiga Cabral Delphino
Resumo
A vacinação é a medida mais eficaz para prevenir a estreptococose causada por Streptococcus agalactiae (S. agalactiae) nas tilapiculturas. Dados sobre a duração da resposta imune humoral e proteção conferida pela vacinação contra o patógeno em tilápias cultivadas são escassos, assim como não há estudos avaliando a eficiência de teste sorológico para monitorar a duração da resposta imune humoral induzida pela vacinação. A franciselose associada a Francisella orientalis (F. orientalis) é responsável por causar doença granulomatosa em peixes. A técnica de squash de tecido associado aos sinais clínicos sugestivos da doença tem sido empregada no diagnóstico inicial da enfermidade à campo, porém não há estudos avaliando a eficácia deste método. Assim, a bacteriologia e o qPCR espécie-especifica são rotineiramente utilizados para o diagnóstico confirmatório de franciselose nos peixes. Contudo, ambas as técnicas requerem eutanásia dos animais para coleta de amostra, sendo impraticável em reprodutores e em larga escala para detecção de peixes portadores. Testes sorológicos associados a coleta de amostras não-letal tem sido utilizado em peixes, entretanto, não existem dados sobre a acurácia diagnóstica dos testes para o diagnóstico da franciselose em tilápias. Portanto, os objetivos deste estudo foram: (i) avaliar a duração da proteção e resposta imune humoral induzida em tilápias do Nilo vacinadas contra S. agalactiae até 300 dias pós-vacinação (dpv), além da utilização de um ELISA indireto como ferramenta para monitorar a resposta imune; (ii) estimar a sensibilidade (DSe) e especificidade (DSp) diagnósticas de um ELISA indireto utilizando análise Bayesiana de Classes Latentes (BCL) comparado ao qPCR espécie-específica para detecção da infecção de F. orientalis em tilápias. Adicionalmente, avaliar a técnica de squash de fragmento do baço para investigar a infecção pelo patógeno nos peixes. No primeiro estudo, amostras de sangue de tilápias vacinadas via intraperitoneal (i.p) com vacina comercial (Vac) e peixes não vacinados (NonVac) foram coletadas aos 15, 30, 150, 180, 210 e 300 dpv, sendo os anticorpos IgM anti-S. agalactiae detectados com sucesso pelo ELISA indireto padronizado no estudo. Os níveis de anticorpos do grupo Vac foram significativamente maiores do que os do grupo NonVac até 180 dpv. Após o desafio experimental com S. agalactiae, foram verificadas médias de mortalidade cumulativa elevadas no grupo NonVac (>65%) e menores do que 35% no Vac, com valores médios de Porcentagem Relativa de Sobrevivência (PRS) variando entre 67 a 94%. Estes resultados sugerem que a vacina comercial administrada em tilápia do Nilo em dose única pode conferir proteção duradoura contra S. agalactiae e o ELISA indireto pode ser usado para monitorar a duração da resposta imune humoral até seis meses após a vacinação. No segundo estudo, um ELISA indireto foi padronizado a partir de tilápias infectadas e não infectadas experimentalmente com F. orientalis. Ao avaliar amostras clínicas obtidas de quatro tilapiculturas em Minas Gerais com diferentes cenários epidemiológicos através da técnica de squash, granulomas foram detectados em todas as fazendas estudadas, entretanto, não permitiu associar a doença granulomatosa a causada somente por F. orientalis. Baseado em um modelo de BCL, as medianas para o DSe e DSp do ELISA indireto foram de 70,8% e 79,0%, respectivamente; enquanto o qPCR espécie-específica apresentou medianas de DSe e DSp maiores que 97%. Assim, a técnica de squash de tecido mostrou-se inapropriada para diferenciar doença granulomatosa causada por diferentes bactérias; o teste de ELISA indireto apresentou acurácia diagnóstica moderada quando comparada com qPCR, porém, atenderia o propósito de detectar animais em populações expostas a franciselose. Este é o primeiro relato da avaliação da acurácia diagnóstica de um ELISA indireto desenvolvido para detecção da infecção de F. orientalis em tilápia do Nilo.
Abstract
Vaccination is the most effective measure for preventing streptococcosis caused by Streptococcus agalactiae (S. agalactiae) in tilapia farming. Data on the duration of the humoral immune response and the protection conferred by vaccination against this pathogen in farmed tilapia are scarce, as well as studies evaluating the effectiveness of serological tests to monitor the duration of the humoral immune response induced by vaccination. Francisellosis associated with Francisella orientalis (F. orientalis) is responsible for causing granulomatous disease in fish. The tissue squash technique, combined with clinical signs suggestive of the disease, has been used for initial field diagnosis. However, no studies have evaluated the efficacy of this method. Therefore, bacteriology and species-specific qPCR are routinely used for confirmatory diagnosis of francisellosis in fish. Both techniques, however, require euthanasia of the animals for sample collection, which is impractical for broodstock or for large-scale detection of carrier fish. Non-lethal sample collection methods, such as serological tests, have been applied to fish, but there are no data on the diagnostic accuracy of these tests for francisellosis detection in tilapia. Thus, the objectives of this study were: (i) to evaluate the duration of protection and humoral immune response induced in Nile tilapia vaccinated against S. agalactiae up to 300 days post-vaccination (dpv) using an indirect ELISA as a tool to monitor the immune response; and (ii) to estimate the diagnostic sensitivity (DSe) and specificity (DSp) of an indirect ELISA using Bayesian Latent Class (BLC) analysis compared to species-specific qPCR for detecting F. orientalis infection in tilapia. Additionally, we aimed to assess the tissue squash technique using spleen fragments to investigate infection by the pathogen in fish. In the first study, blood samples were collected from tilapia vaccinated intraperitoneally (i.p.) with a commercial vaccine (Vac) and non-vaccinated fish (NonVac) at 15, 30, 150, 180, 210, and 300 dpv, with anti-S. agalactiae IgM antibodies successfully detected by the standardized indirect ELISA. Antibody levels in the Vac group were significantly higher than in the NonVac group up to 180 dpv. After the experimental challenge with S. agalactiae, the NonVac group showed high cumulative mortality (>65%), while the Vac group had mortality rates lower than 35% with relative percentage survival (RPS) values ranging from 67 to 94%. These results suggest that a single-dose commercial vaccine can provide long-lasting protection in Nile tilapia against S. agalactiae, and the indirect ELISA can be used to monitor the duration of the humoral immune response for up to six months post-vaccination. In the second study, an indirect ELISA was standardized using tilapia experimentally infected and non-infected with F. orientalis. When evaluating clinical samples obtained from four tilapia farms in Minas Gerais with different epidemiological scenarios through the tissue squash technique, granulomas were detected in all studied farms; however, the method not allowed associate the granulomatous disease with F. orientalis. Based on a BLC model, the median DSe and DSp for the indirect ELISA were 70.8% and 79.0%, respectively, while species-specific qPCR had medians for DSe and DSp greater than 97%. Thus, the tissue squash technique proved inappropriate for differentiating granulomatous diseases caused by different bacteria, and the indirect ELISA showed moderate diagnostic accuracy compared to qPCR, although it would serve the purpose of detecting animals in populations exposed to francisellosis. This is the first report on the evaluation of the diagnostic accuracy of an indirect ELISA developed for the detection of F. orientalis infection in Nile tilapia.
Assunto
Palavras-chave
Peixe, Tilápia