Modelos mesoscópicos para DNA mediado por metal e na presença de solventes que simulam o meio molecular
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
Descrição
Tipo
Tese de doutorado
Título alternativo
Mesoscopic models for metal mediated DNA and in the presence of molecular crowders
Primeiro orientador
Membros da banca
Ubirajara Agero Batista
Elso Drigo Filho
Márcio Santos Rocha
Mariana Torquato Quezado de Magalhães
Elso Drigo Filho
Márcio Santos Rocha
Mariana Torquato Quezado de Magalhães
Resumo
Ácidos nucleicos, em especial DNA e RNA, têm importância biológica e tecnológica
inegável. Aqui, desenvolvemos dois projetos relacionados à estabilidade de ácidos nucleicos. No
primeiro projeto abordamos o efeito de íons metálicos, Hg2+ e Ag+ , que se ligam entre as bases
do DNA (M-DNA). Esses íons têm potencial tecnológico para serem usados como biosensores.
No segundo projeto, abordamos a questão do efeito de polietilenoglicol (PEG) na desnaturação do
DNA. O PEG simula o efeito do confinamento molecular, representando macro- e micro-moléculas
existentes na célula, o que é um importante problema em biologia molecular. Para o desenvolvimento
destes projetos, usamos dados de desnaturação UV presentes na literatura e utilizamos modelos
mesoscópicos, principalmente o modelo Peyrard-Bishop (PB), para calcular as interações presentes
no sistema.
M-DNA é uma molécula de DNA em que a ligação de hidrogênio entre as bases é substituída
por um íon metálico. No DNA natural, apenas os íons Ag+ e Hg2+ apresentam efeito estabilizador.
No entanto, não está claramente estabelecido se estes íons o fazem por uma ligação covalente
base-metal-base, ligação direta, ou se há outro mecanismo em questão, como alterações no efeito de
empilhamento (stacking), ligações interplanares. Sabe-se que Ag+ estabiliza citosina-citosina (CC),
enquanto Hg2+ estabiliza timina-timina (TT). Ou seja, os íons estabilizam pares de base do tipo
mismatch, que normalmente são bastante instáveis. Em nossos resultados, vimos que Hg2+ estabiliza
por meio de ligação base-metal-base próxima ao valor de um par CG, enquanto para Ag+ temos o
mesmo tipo de estabilização, porém com intensidade próxima à de um par AT. Valores pequenos
de empilhamento CC-CC para Ag+ e TT-TT para Hg2+ descartam interações interplanares. Com
isto estabelecemos que modelo mesoscópico, a partir dos dados experimentais disponíveis, pode
determinar conclusivamente a origem do efeito estabilizante do íon metálico.
Para compreender os efeitos intramoleculares de DNA e RNA, os experimentos in vitro são
comumente realizados em solução de água e sal, livre de outros aditivos. Isto é muito diferente do
conteúdo celular, que contém cerca de 20-40% de macro- e micro-moléculas. Portanto, não se sabe
até que ponto os resultados destes experimentos correspondem ao que ocorre com essas moléculas
no ambiente celular. Para estudar estes efeitos, costuma-se adicionar polietilenoglicol (PEG), que
está disponível numa variedade de massas moleculares e, por isto, oferece uma maneira simples
e controlada para simular experimentalmente o efeito da presença de micro- e macro-moléculas.
PEGs com massas moleculares menores do que 1000 (PEG200, por exemplo) se comportam como
micro-moléculas e desestabilizam o DNA, sendo que com massa maior (PEG2000, por exemplo)
agem como macro-moléculas e estabilizam o DNA. Muitos autores modificaram o modelo PB
adicionando um termo no potencial de Morse para descrever a interação dos nucleotídeos com
solvente, no entanto, estes modelos nunca foram validados com dados experimentais. Por ser um
campo recente, apenas agora dispomos de dados experimentais suficientes para estudar se os modelos
de fato descrevem o efeito que as moléculas de água (H2 O) tem sobre os nucleotídeos. Neste estudo,
comparamos situações de solução aquosa na presença ou ausência de PEG200 em DNA (baixa
concentração de sal, Na+ =100 mM) e RNA (baixa concentração de sal, Na+ =100 mM, e alta
concentração de sal, Na+ =1000 mM). Nossos resultados mostram que o RNA é mais hidratado
do que o DNA. Na presença de PEG200 a diferença de energia entre os pares AT e CG no DNA,
e AU e CG no RNA, aumentam, porém no RNA a diferença de energia é bem menor. Grandes
diferenças de energia entre os pares de base podem causar distorções na dupla hélice. Neste caso,
o DNA na presença de PEG200 pode estar assumindo um outro tipo de conformação, hélice
do tipo B, predominante em soluções com água, para uma hélice de tipo A, predominante em
soluções com menos água disponível. Valores de energia AT na presença e ausência de PEG200
são praticamente iguais. Este resultado confirma que hélices de DNA homogêneas AT só existem
no tipo B independente da mudança de hidratação do par de base. Dentre os modelos PB com
barreira analisados, apenas o modelo Hamiltoniano Morse Solvente (HMS− ) conseguiu predizer
as temperaturas de desnaturação de maneira equivalente, pois os parâmetros das qualidades das
predições são pequenos. Na ausência de PEG200 e baixas concentrações de sal as energias de
barreira são praticamente iguais. Ao contrário do que acontece em altas concentrações de sal, onde a
barreira de CG é um pouco maior do que AU. Além de ser mais hidratado, o RNA concentra mais
íons do que o DNA, por este motivo observamos uma redução da barreira de energia na presença
de PEG200. O modelo HMS− explica muito bem a interação nucleotídeo-solvente-nucleotídeo.
Logo, encontramos um modelo PB modificado que explica uma parte da dinâmica dos nucleotídeos
inexistente no modelo PB original.
Abstract
Nucleic acids, in special DNA and RNA, have undeniable technological and biological
importance. Here, we develop two projects linked to the stability of nucleic acids. In the first, we
discuss the effects of metallic ions that bind between the base pairs of DNA (M-DNA), and which has
technological potential to be used as biosensors. In the second, we address the effect of polyethylene
glycol, that simulates the crowding effect in the denaturation of DNA, an important problem in
molecular biology. For the development of these projects we use UV published melting. In addition,
we use mesoscopic models, mainly the Peyrard-Bishop (PB), to calculate the interactions present in
the system.
M-DNA is a DNA molecule where the hydrogen bond between the bases is changed due
to the presence of a metallic ion. In natural DNA, only Ag+ and Hg2+ have a stabilizing effect.
However, there is no clear understanding if these ions stabilize the DNA via a direct bond, covalent
bond base-metal-base, or via another mechanism such as interplanar interactions, stacking between
the nearest-neighbouring bases. We know that Ag+ stabilizes the cytosine-cytosine (CC) mismatch,
while Hg2+ stabilize the thymine-thymine (TT) mismatch. In other words, the cations stabilize
mismatches, who are otherwise quite unstable. Our results show that Hg2+ stabilizes the DNA via the
pair base-metal-base which has a strength similar to a CG pair, while for Ag+ the stabilization process
is the same, however with a strength somewhat weaker than an AT base pair. The small stacking
interactions of CC-CC for Ag+ and TT-TT for Hg 2+ does not support interplanar interactions which
were hypothesized by some authors. Therefore, mesoscopic models can conclusively explain the
origin of the metal ion stabilizing effect from experimental data available.
To understand the intramolecular effects in DNA and RNA, in vitro experiments are com-
monly performed in saline solutions, free of other compounds. This is very different from the cell
environment that has a myriad of molecules, the cell volume is composed of 20-40% of micro-
and macro-molecules. Therefore, it is not know how far the results of the experiments can explain
what really happens on the molecular environment. To study these effects it is customary to add
polyetylene glycol (PEG), which is available in a variety of molecular weights and therefore offers
a simple and controlled way to experimentally simulate the effect of micro-and macro-molecules
on the nucleotides. PEGs with molecular weights lower than 1000 (PEG200, for instance) behave
like micromolecules and destabilize the DNA, while PEGs with molecular weights greater act as
macromolecules and stabilize the DNA. Several authors proposed modifications to the PB model
by adding a term in the Morse potential to describe the interaction of nucleotides with the solvent,
water in particular, but these models have never been subject to validation with experimental data.
Only recently have enough experimental data become available to study whether the models actually
describe the effect that H2O molecules have on nucleotides, giving us the opportunity to apply
the PB model in this type of system. In this thesis, we compare DNA (low salt concentration,
[Na+ ]=100 mM) and RNA (low, [Na+ ]=100 mM, and high, [Na+ ]=1000 mM, salt concentration)
aqueous solution in two situations: with PEG200 and without PEG200. Our results confirms that
RNA is more hydrated than DNA. The energy difference between AT and CG, DNA, and AU e
CG, RNA, increases when we add PEG200, but in RNA the energy difference is much smaller.
Large energy differences between the base pairs cause distortions in the conformation of the double
helix. In this case, DNA in the presence of PEG200 may be assuming another type of conformation.
DNA B-type helix, characteristic in water solutions, changes to an A-type helix, characteristic in
solutions with less water available. AT energy values with and without PEG200 are practically the
same. This result confirms that homogeneous AT DNA helices assumes only B-type conformation
regardless of the hydration change. Among the barrier-modified PB models analysed, only the
HMS− was found to adequately predict melting temperatures. In the absence of PEG200 and low
salt concentrations the barrier energies were found to be the same. Different to what happens at high
salt concentrations, where the CG barrier is a little higher than the AU barrier. RNA concentrates
more ions and it is more hydrated than DNA, for this particularly reason we observe a reduction in
the barrier energy with PEG200. The HMS− model was found to provide a satisfactorily description
of the nucleotide-solvent-nucleotide interaction. Therefore, we found a modified PB model that can
explain the intermediate state in the duplex separation process, absent of the standard PB model.
Assunto
Biofísica, DNA
Palavras-chave
Desnaturação UV, Nucleotídeos, DNA mediado por metal (M-DNA), Ag+, Hg2+, Ambiente macromolecular, PEG, Hidratação, Modelo Peyrard-Bishop (PB), Modelo PB com barreira