Expressão e purificação de análogo do fator estimulador de colônia de granulócito humano recombinante visando à produção de medicamento biológico biossimilar.
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
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Tipo
Dissertação de mestrado
Título alternativo
Primeiro orientador
Membros da banca
Miguel Angel de la O Herrera
Ricardo Toshio Fujiwara
Ricardo Toshio Fujiwara
Resumo
Os medicamentos biológicos constituem um grande arsenal terapêutico para o tratamento de diversas doenças severas e/ou raras. Um exemplo desses é o análogo do fator estimulador de colônia de granulócito humano recombinante (filgrastim), uma proteína recombinante produzida em Escherichia coli. O filgrastim é indicado para quadros de neutropenia, por estimular os processos de proliferação, maturação, sobrevivência e funcionalidade de neutrófilos. A versão peguilada, o pegfilgrastim, devido à meia vida maior, permite uma única dose por ciclo quimioterápico e, consequente, melhor adesão terapêutica pelos pacientes. Apesar das vantagens, os tratamentos com biológicos geram um alto custo para o Sistema Único de Saúde devido principalmente à necessidade de importação destes medicamentos e às custosas etapas de purificação ao longo do processo produtivo. Neste sentido, o objetivo do trabalho foi o desenvolvimento de processo produtivo para a obtenção da proteína filgrastim, por meio da análise de diferentes estratégias que simplifiquem as etapas de purificação, visando, futuramente, produção nacional de um biossimilar da versão peguilada do filgrastim. Neste sentido, quatro diferentes construções do vetor pET29a(+) foram sintetizadas e transformadas por eletroporação em cepas BL21(DE3) de E. coli. Para a obtenção da proteína na região do periplasma (psPE-FGT) e no meio de cultivo (imPE-FGT), fez-se uso, respectivamente, do peptídeo sinal e da proteína emulsficante (PE) imatura fusionados ao filgrastim, sendo o cultivo realizado em meio SDAB e diferentes temperaturas. Para a obtenção da proteína no citoplasma, uma construção com apenas a sequência do filgrastim (0-FGT) e outra com este fusionado a uma his-tag (HE-FGT) foram utilizadas, sendo os cultivos realizados com meio 4xYT a 37°C e a 18°C. Após o processamento das suspensões celulares, as purificações foram realizadas em sistema cromatográfico ÄKTA pure 150M com a utilização de colunas específicas para cada estratégia de obtenção. As frações obtidas ao longo do processo foram avaliadas por SDS-PAGE e a identidade aminoacídica das proteínas-alvo foram analisadas por espectrometria de massa em Orbitrap Velos e MALDI-TOF/TOF. Os resultados da construção psPE-FGT demonstraram a capacidade do peptídeo sinal, a 23 °C, em exportar a proteína-alvo fusionada para região do periplasma. Já para a construção imPE-FGT não foi possível obter informações suficientes acerca da expressão e capacidade de exportação da proteína imatura fusionada a um alvo para o meio de cultivo. Para a 0-FGT verificou-se que a 18 °C foi possível obter o filgrastim na fração insolúvel, na forma de corpo de inclusão não clássico. Sua extração foi feita com uma solução de baixa concentração de detergente e retirada de grande quantidade de contaminantes, sendo empregada uma única etapa cromatográfica de troca aniônica. Por fim, para HE-FGT a 18°C obteve-se a proteína-alvo tanto na fração solúvel quanto na insolúvel. Todas essas formas de obtenção apresentam a vantagem de simplificar o processamento downstream, de modo a favorecer a produção nacional de medicamentos biológicos a preços de menor custo, favorecendo o acesso à população.
Abstract
Biopharmaceuticals represent a significant therapeutic resource for the treatment of various severe and/or rare diseases. An example of this type of medication is the analogue of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (filgrastim), a recombinant protein produced in Escherichia coli. Filgrastim is indicated for the treatment of neutropenia, as it stimulates the proliferation, maturation, survival, and functionality of neutrophils. The pegylated version, pegfilgrastim, due to its longer halflife, permits a single dose per chemotherapy cycle and, consequently, better therapeutic adherence by patients. However, despite its advantages, treatments with biological medicines generate high costs for the Unified Health System (SUS), mainly due to the need to import these medicines and the costly purification steps throughout the production process. The objective of this study was to develop a production process for obtaining the filgrastim protein by analyzing different strategies to simplify the purification stages, aiming to produce a biosimilar of the pegylated version of filgrastim in Brazil in the future. To this end, four different constructs of the pET29a(+) vector were synthesized and transformed by electroporation into BL21(DE3) strains of E. coli. To obtain the protein in the periplasmic region (psPE-FGT) and in the culture medium (imPE-FGT), the signal peptide and the immature emulsifying protein (EP) fused to filgrastim were used, respectively, and the culture was carried out in SDAB medium at different temperatures. To obtain the protein in the cytoplasm, a construct with only the filgrastim sequence (0-FGT) and another with it fused to a his-tag (HEFGT) were used, and the cultures were carried out in 4xYT medium at 37°C and 18°C. After processing the cell suspensions, the purifications were carried out in a ÄKTA pure 150M chromatographic system using specific columns for each obtaining strategy. The fractions obtained during the process were evaluated by SDS-PAGE and the amino acid identity of the target proteins was analyzed by mass spectrometry on Orbitrap Velos and MALDI-TOF/TOF. The results obtained with the psPE-FGT construction demonstrated the ability of the signal peptide, at 23 °C, to export the fused target protein to the periplasm region. For the imPE-FGT construct, it was not possible to obtain sufficient information about the expression and export capacity of the immature protein fused to a target into the culture medium. For the 0-FGT construction, it was observed that at 18°C, filgrastim was obtained in the insoluble fraction as a nonclassical inclusion body. The extraction was performed using a solution with low detergent concentration and a large number of contaminants were removed, using a single anion exchange chromatographic step. Finally, for HE-FGT at 18°C, the target protein was obtained in both soluble and insoluble fractions. All these methods of production have the advantage of simplifying the downstream processing, thereby promoting the production of biopharmaceuticals at lower costs, thus improving access for the population.
Assunto
Palavras-chave
Produtos biológicos, Biofármacos, Filgrastim, Escherichia coli.