Estudo do papel das proteínas MSH2 e MSH6 na resposta a danos no DNA em Trypanosoma cruzi
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
Descrição
Tipo
Dissertação de mestrado
Título alternativo
Primeiro orientador
Membros da banca
Silvane Maria Fonseca Murta
Fabiana Simão Machado
Fabiana Simão Machado
Resumo
O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas, apresenta uma estrutura
populacional altamente heterogênea, caracterizada pela ocorrência de diferentes cepas com
características morfológicas e bioquímicas distintas. Essa estrutura populacional complexa
pode estar relacionada às diferentes manifestações clínicas da doença, à capacidade do
parasito de infectar diferentes hospedeiros e à distribuição geográfica apresentada pelas
cepas. A variabilidade intra-específica é resultante de um balanço entre a manutenção da
estabilidade genômica e a geração de variabilidade genética. Diversos mecanismos estão
envolvidos na manutenção deste equilíbrio, entre eles, o sistema de reparo de DNA por
erros de pareamento ou MMR. Estudos iniciais sobre o MMR em T. cruzi levaram à
descoberta de que o MSH2 – a principal proteína do MMR – existe em três isoformas
diferentes no parasita, denominadas TcMSH2 A, B e C, de acordo com os dados de
seqüências de Tcmsh2 presente no genoma de diferentes cepas. Evidencias experimentais
indicam que cepas apresentando a isoforma TcMSH2 A apresentam um MMR mais
eficiente quando comparadas a cepas que possuem as isoformas TcMSH2 B e/ou C. Essas
observações nos levaram a especular que as diferenças na atividade do MMR poderiam ser
responsáveis pela menor variabilidade genética encontrada em cepas pertencentes aos
haplogrupos de MSH2-A. Com o objetivo de investigar o papel da proteína MSH2, foi
planejada a obtenção de parasitas nocautes para este gene. Análises dos parasitas
heminocautes de Tcmsh2 demonstraram que, apesar destes não apresentarem diferenças
frente ao tratamento com agentes mutagênicos, estes são mais susceptíveis ao tratamento
com peróxido de hidrogênio e acumulam mais 8-oxoguanina no DNA mitocondrial do que
parasitas selvagens. Para verificar o papel de TcMSH2 na resposta ao estresse oxidativo,
no presente trabalho foram feitos experimentos buscando elucidar a localização da proteína
no parasita. Para tal, anticorpos produzidos em camundongos contra uma forma
recombinante de TcMSH2 foram utilizados em ensaios de imunolocalização e western
blot. Esses experimentos mostraram que os soros produzidos reconhecem proteínas nativas
de T. cruzi apresentando massas moleculares diferentes, e ainda que essas proteínas apresentam localização subcelular distintas. Isso nos levou a propor que a forma de menor
massa molecular, localizada em extrato protéico correspondente à fração citoplasmática,
estaria envolvida no reparo do DNA mitocondrial. Paralelamente, para avaliar se o papel
de TcMSH2 na resposta a danos oxidativos dependia de outras proteínas da via de MMR,
iniciamos a caracterização das mesmas. Para tal, foram geradas construções para deleção
do gene Tcmsh6. Como estratégia adicional, a fim de elucidar o papel de TcMSH6, demos
início, também, a experimentos tentando determinar a sua localização subcelular, através
da sua expressão em fusão com RFP.
Abstract
Trypanosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease, presents a highly
heterogeneous population structure, characterized by the occurrence of different strains
with different biochemical and morphological characteristics. This complex population
structure may be correlated with different clinical manifestations of disease, parasite's
ability to infect different hostages and geographical distribution presented by the strains.
Intra-specific variability can be a result of a balance between genomic stability and
generation of genetic variability. Several mechanisms can be involved in maintaining this
balance, for example, DNA mismatch repair – MMR. Initial studies on the MMR in T.
cruzi led to the discovery that MSH2 - the main protein of the MMR - exists in three
isoforms in the parasite, named TcMSH2 A, B and C, according to Tcmsh2 data sequences
present in the genome of different strains. Experimental evidence indicates that strains
presenting the isoform TcMSH2 A have a more efficient MMR when compared to strains
that have TcMSH2 B and/or C isoforms. These observations led us to speculate that
differences in MMR activity could account for a lower genetic variability found in strains
belonging to MSH2-A haplogroup. In order to investigate the role of the MSH2 protein, we
tried to obtain knockout parasites for this gene. Single knockouts parasites are more
susceptible to hydrogen peroxide treatment and accumulate more 8-oxoguanine in
mitochondrial DNA than wild type parasites, despite the fact that there are no differences
after treatment with mutagenic agents. With the aim to better investigate the role of MSH2
in response to oxidative stress, in the present work we investigated MSH2 cellular
localization. Antibodies raised against a recombinant form of MSH2 produced in mice
were used in immunolocalization and western blot assays. Those experiments have shown
that the serum produced in mice is able to recognize the native protein in two different
molecular weight proteins, with different subcellular localization. Based on that, we have
speculated that the lower molecular weight protein, which is localized at extract fraction
correspondent to the cytoplasm, could be involved in mitochondrial DNA repair.
Simultaneously, to investigate if TcMSH2 role in response to oxidative damage is dependent of other MMR proteins, we began to characterize them. Two different strategies
were used to knockout Tcmsh6. And we also tried to elucidate TcMSH6 subcellular
localization after its over-expression in fusion with RFP.
Assunto
Bioquímica e imunologia, Trypanosoma cruzi, Doença de Chagas, Reparo de Erro de Pareamento de DNA
Palavras-chave
Trypanosoma cruzi, Doença de chagas, MMR, DNA