Identificação de epitopos lineares de célula B conservados e polimórficos em diferentes cepas de Trypanosoma cruzi com potencial aplicação para sorotipagem
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Dissertação de mestrado
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Resumo
Durante a fase crônica da doença de Chagas, devido a baixa parasitemia e
altos títulos de anticorpos anti-T.cruzi, o diagnóstico é realizado preferencialmente
por testes sorológicos. Porém, resultados inconclusivos ou contraditórios
principalmente relacionados as características dos antígenos utilizados são
observados. Os fatores que influenciam as manifestações clínicas da doença de
Chagas não são bem conhecidos, mas ambas as variações genéticas dos hospedeiros e
do parasito parecem estar envolvidos. Vários estudos tentando correlacionar a cepa de
T. cruzi envolvida na infecção com manifestações clínicas da doença, usando
hemocultura e/ou genotipagem baseada em PCR dos parasitos originados de tecidos
humanos infectados, porém, ambas as técnicas possuem limitações. O objetivo deste
trabalho foi identificar epitopos lineares de célula B conservados e polimórficos entre
as cepas de T. cruzi por predição in silico e triagem experimental. Proteínas derivadas
de genes cópias simples representados por pares de alelos no genoma de CL Brener
foram os alvos deste estudo. Esta estratégia foi utilizada porque CL Brener é um
recente híbrido entre as linhagens TcII e Tc III, e epitopos polimórficos existentes
entre os pares de alelos de CL Brener podem também ser polimórficos nos genótipos
parentais. A reatividade de 150 peptídeos foi avaliada utilizando soro de
camundongos C57BL/6 cronicamente infectados com as cepas Y (TcII), Colombiana
(TcI) e CL Brener (TcVI) de T. cruzi. Um total de 36 peptídeos foram considerado
reativos e a reatividade cruzada entre as cepas está em concordância com a origem
evolucionária das diferentes linhagens de T. cruzi. Dois peptídeos similarmente
reativos com as diferentes cepas e três com reatividade específica para cada cepa
foram sintetizados em solução e testados em experimentos de ELISA e ELISA de
afinidade. Um dos peptídeos com reatividade similar entre as cepas apresentou
reatividade sem diferença estatística entre as cepas e foi reconhecido por anticorpos
de média afinidade com uma especificidade de 93% e sensibilidade de 87%. Este
peptídeo também foi diferencialmente reconhecido por soros de pacientes chagásicos
com a forma cardíaca quando comparado com soro de pacientes com a forma
indeterminada da doença e poderiam ser usado, além do sorodiagnóstico, para
prognóstico ou auxílio na identificação de manifestações clínicas. O outro apresentou
baixos valores de especificidade de (35%) e de sensibilidade (58%). O peptídeo
reativo com a cepa Y também foi reativo com soro de pacientes infectados com TcI e os aminoácidos críticos para o reconhecimento por anticorpos foram identificados
apenas no par de alelo pertencente ao haplótipo Esmo. De forma contrária, o peptídeo
reativo apenas com Colombiana não foi reconhecido por soro de pacientes chagásicos
infectados com TcII e o mapeamento dos aminoácidos mostrou que apenas o par de
alelo do haplótipo Non-esmo possui o padrão de ligação a anticorpos. O último
peptídeo discriminou corretamente a cepa CL Brener. Os três peptídeos polimórficos
foram derivados de regiões repetitivas e juntos apresentaram um alto potencial uso
para sorotipagem do parasito.
Abstract
During chronic phase of Chagas disease, because of the low parasitemia and
high anti-T.cruzi antibody titers, the diagnosis is made preferably by serological tests.
However, contradictory or inconclusive results mainly related to the characteristics of
the antigens used are observed. The factors influencing the variation in the clinical
manifestation of Chagas disease have not been elucidated, but it is likely that genetic
of the host and parasite is involved. Several studies trying to correlate the parasite
strain and clinical manifestation have used hemoculture or PCR-based genotyping.
However, both techniques have limitations. The goal of this work is to identify T.
cruzi conserved and polymorphic B-cell linear epitopes that could be used for
serodiagnostic and serotyping using ELISA. We have performed B-cell epitope
prediction on proteins derived from single copy genes represented by pair of alleles in
the CL Brener genome. The rationale behind this strategy is that because CL Brener is
a recent hybrid between TcII and TcIII lineages, it is likely that polymorphic epitopes
in its pair of alleles could also be polymorphic in the parental genotypes. The
reactivity of 150 peptides has been tested using sera from C57BL/6 mice chronically
infected with Colombiana (TcI) and CL Brener (TcVI) clones and Y (TcII) strain. A
total of 36 peptides were reactive and the cross-reactivity between the strains is in
agreement with the evolutionary origin of the different T. cruzi lineages. Two peptides
similarly reactive with different strains and three with reactivity specific for each
strain were synthesized in solution and tested in ELISA and ELISA affinity
experiments. One of the peptides with similar reactivity showed no statistical
difference between the strains and was recognized by intermediate affinity antibodies
with 93% of specificity and sensitivity of 87%. This peptide was also differentially
recognized by sera from chagasic patients with the cardiac form compared with serum
from patients with the indeterminate form of the disease. In addition to the
serodiagnosis, it could be used to prognosis or to aid in the identification of clinical
manifestations. The other peptide had low specificity (35%) and sensitivity (58%)
values . The peptide reactive with the Y strain was also reactive with sera from
patients infected with TcII and the amino acid critical for recognition by antibodies
were identified only in the allele of haplotype Esmo. Conversely, the peptide reactive
only with Colombia was not recognized by sera from patients infected with TcII and mapping of the amino acids showed that only the allele of Non-esmo haplotype has
the pattern of antibodies binding. The last peptide correctly discriminated strain CL
Brener. The three peptides were derived from polymorphic repetitive regions and
together had a high potential use for serotyping of the parasite.
Assunto
Parasitologia, Doença de Chagas, Trypanosoma cruzi, Parasitemia, Reação em Cadeia da Polimerase, Epitopos de Linfócito B
Palavras-chave
Doença de Chagas, Parasitemia, PCR, T. cruzi.