Composições farmacêuticas com atividade osteogênica com proteínas hidrolisadas da seda: estudo in vitro e in vivo
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Tipo
Tese de doutorado
Título alternativo
Primeiro orientador
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Alejandro Pelaez Vargas
Ivana Mdrcia Alves Diniz
Marcelo Gomes Speziali
Pedro Pires Goulart Guimarães
Ivana Mdrcia Alves Diniz
Marcelo Gomes Speziali
Pedro Pires Goulart Guimarães
Resumo
Moléculas bioativas, como as proteínas, desempenham um papel fundamental na promoção da regeneração óssea, influenciando diretamente o desempenho dos biomateriais de regeneração. Nesta tese, se estudiou o comportamento das proteínas hidrolisadas de seda incorporadas em formulações compósitos cimentantes para a regeneração óssea, além disso, realizou-se uma prospecção em base de artigos e patentes. A análise detalhada dos dados obtidos permitiu traçar um panorama abrangente sobre o desenvolvimento científico e tecnológico relacionado às proteínas da seda (fibroina e sericina), associado a biomateriais de regeneração óssea como a hidroxiapatita e quitosana. Os resultados evidenciam um crescimento expressivo nas publicações e patentes ao longo das últimas duas décadas, refletindo o aumento do interesse global por soluções inovadoras na engenharia de tecidos e regeneração óssea. Experimentalmente se prepararam duas formulações de fase solida consistindo em hidroxiapatita e agalmatolito (C1) e hidroxiapatita, agalmatolito e quitosana (C2), combinadas com diferentes concentrações de proteínas hidrolisadas de seda (fase líquida): 0%, 1%, 10% e 25%. Os compósitos cimentantes foram caracterizados físico-quimicamente, in vitro e in vivo. As análises de difração de raios X e espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier confirmaram a incorporação das proteínas da seda nas formulações. A estabilidade térmica foi alterada pela presença de quitosana. Imagens de microscopia eletrônica de varredura revelaram superfícies irregulares e porosas, com alterações morfológicas associadas à adição das proteínas. A bioatividade em fluido corporal simulado foi confirmada pela formação de uma camada de apatita na superfície dos cimentos. Observou-se liberação contínua de íon de Ca²⁺, com menor liberação nas formulações contendo quitosana. O pH de todas as formulações permaneceu estável em 7,4. Nos testes de molhabilidade, a presença de quitosana conferiu caráter hidrofílico aos compósitos, enquanto a adição de proteínas da seda aumentou ainda mais essa propriedade conforme a concentração aumentava. Os testes biológicos confirmaram a biocompatibilidade das formulações, promovendo a proliferação de co-culturas de fibroblastos L929 e pré-osteoblastos MC3T3. Os cimentos com quitosana apresentaram melhor viabilidade em testes indiretos, enquanto os cimentos sem quitosana mostraram desempenho superior em comparação aos que continham quitosana. Ensaios específicos de marcadores de regeneração óssea, como atividade de fosfatase alcalina, osteocalcina, óxido nítrico e mineralização, apresentaram resultados promissores para a regeneração tecidual. Nos testes in vivo, foram avaliadas as formulações C2 (com quitosana) em todas as concentrações, e as análises histológicas indicaram diferentes níveis de integração e estímulo à regeneração óssea. Observou-se infiltrado inflamatório em todos os grupos, com diminuição progressiva e presença de fibras colágenas. Os cimentos C2-1 e C2-10 apresentaram menor quantidade de osteoclastos TRAP-positivos em comparação ao C2-25, que exibiu maior resposta inflamatória. A análise histomorfométrica revelou que formulações com concentrações menores de proteínas favoreceram mais a formação óssea ou apresenta o mesmo nível de regeneração que as concentração maiores. Os resultados obtidos evidenciam o potencial dos compósitos cimentantes desenvolvidos, especialmente aqueles com menores concentrações de proteínas hidrolisadas de seda, para aplicações em regeneração óssea.
Abstract
Bioactive molecules, such as proteins, play a fundamental role in promoting bone regeneration by directly influencing the performance of regenerative biomaterials. In this thesis, the behavior of hydrolyzed silk proteins incorporated into cement composite formulations for bone regeneration was investigated. In addition, a technology and literature survey was carried out based on scientific articles and patents. A detailed analysis of the collected data provided a comprehensive overview of the scientific and technological development related to silk proteins (fibroin and sericin), associated with bone regeneration biomaterials such as hydroxyapatite and chitosan. The results demonstrate a significant increase in publications and patents over the last two decades, reflecting the growing global interest in innovative solutions for tissue engineering and bone regeneration. Experimentally, two solid-phase formulations were prepared: one consisting of hydroxyapatite and agalmatolite (C1), and another consisting of hydroxyapatite, agalmatolite, and chitosan (C2), both combined with different concentrations of hydrolyzed silk proteins (liquid phase): 0%, 1%, 10%, and 25%. The cement composites were characterized physicochemically, in vitro, and in vivo. X-ray diffraction and Fourier-transform infrared spectroscopy analyses confirmed the incorporation of silk proteins into the formulations. Thermal stability was altered by the presence of chitosan. Scanning electron microscopy images revealed irregular and porous surfaces, with morphological changes associated with the addition of proteins. Bioactivity in simulated body fluid was confirmed by the formation of an apatite layer on the surface of the cements. Continuous Ca²⁺ ion release was observed, with lower release rates in formulations containing chitosan. The pH of all formulations remained stable at 7.4. In wettability tests, the presence of chitosan imparted a hydrophilic character to the composites, while the addition of silk proteins further enhanced this property as concentration increased. Biological tests confirmed the biocompatibility of the formulations, promoting the proliferation of co-cultures of L929 fibroblasts and MC3T3 pre-osteoblasts. Cements containing chitosan showed better viability in indirect tests, whereas cements without chitosan showed superior performance compared to those containing chitosan. Specific assays for bone regeneration markers, such as alkaline phosphatase activity, osteocalcin, nitric oxide, and mineralization, showed promising results for tissue regeneration. In the in vivo tests, C2 formulations (with chitosan) at all concentrations were evaluated, and histological analyses indicated varying levels of integration and stimulation of bone regeneration. Inflammatory infiltration was observed in all groups, with progressive reduction and presence of collagen fibers. C2-1 and C2-10 cements showed fewer TRAP-positive osteoclasts compared to C2-25, which exhibited a stronger inflammatory response. Histomorphometric analysis revealed that formulations with lower protein concentrations favored greater bone formation or achieved the same level of regeneration as higher concentrations. The results highlight the potential of the developed cement composites, especially those with lower concentrations of hydrolyzed silk proteins, for applications in bone regeneration.
Assunto
Quitosana, Regeneração óssea guiada, Cimentos dentarios, Patentes, hidroxiapatita
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