Relação entre a expressão de CD44-ICD e a inibição de metaloproteinases na progressão de melanomas: estudo in vitro e in vivo
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Resumo
Melanoma é uma neoplasia altamente metastática, com comportamento agressivo, invasivo e alta resistência ao tratamento. Tem sido demonstrado durante sua progressão a importância do remodelamento da matriz extracelular (MEC) via metaloproteinases (MMPs), facilitando processos como a migração, invasão e formação de metástases. Nesse contexto, as MMPs interagem com moléculas de adesão, como o CD44 promovendo sua clivagem, gerando o domínio intracitoplasmático (ICD) que é translocado para o núcleo ativando transcrição de genes relacionados a migração, invasão e implantação tumoral. Consequentemente, se a clivagem puder ser impedida por inibidores de metaloproteinases, pode servir como possível alvo de inibição da progressão tumoral e metástase. Assim, este trabalho teve por objetivo investigar os efeitos da inibição de metaloproteinases a partir do uso de doxiciclina, sobre a progressão de melanoma no modelo murino. Foram utilizadas células B16-F10 cultivadas sob condições normais e tratadas com 1, 5 e 10μM de doxiciclina por 24 e 48 horas. Foi avaliada a viabilidade pelo ensaio do MTT, seguido dos ensaios de migração, invasão, ciclo celular e zimografia. Para o ensaio in vivo, as células tratadas com as mesmas concentrações de doxiciclina foram inoculadas em camundongos C57BL/6, fêmeas, de 10 semanas, pela veia caudal. Após 21 dias os animais foram anestesiados e a função pulmonar avaliada por espirometria, posteriormente foram eutanasiados e o pulmão coletado para análise histopatológica e imunohistoquímica. Os resultados demonstraram que a doxiciclina induziu aumento na viabilidade das células B16-F10, com resultados significativos em 24 horas e 48 horas no grupo que recebeu células tratadas com doxiciclina 10μM, comparado aos grupos controle e que recebeu células tratadas com doxiciclina 1μM (p<0,05 e p<0,01 respectivamente). A análise da capacidade gelatinolítica indicou redução da atividade da MMP-9 na concentração de 1μM em 24 horas e inibição na concentração 10μM em 24 e 48 horas (p<0.01; p<0.001 respectivamente). A análise da mecânica pulmonar revelou redução nos níveis de FVC, Cdyn e FEV100 nos animais que receberam células tratadas com 10μM quando comparados ao controle (p<0,05). As áreas pulmonares afetadas por metástases nos animais que receberam células tratadas com 1μM e 10μM de doxiciclina foram maiores do que as dos animais do controle (p<0,05). A imunohistoquímica revelou menor expressão de MMP-14 e CD44 em pulmões com implantes pulmonares de animais que receberam células tratadas com doxiciclina quando comparado ao controle (p<0.0001), sem alterações relevantes na expressão de CD44-ICD (p<0.0001) e diminuição na expressão de MMP-9. Além disso, observou-se relação entre índice proliferativo CDC47 e a área afetada por metástases (r=0.9505; p<0,05), além da expressão de MMP-9 e MMP-14 (r=0.7959; r=0.814 respectivamente, p<0,05). Nossos dados sugerem que o tratamento in vitro de células B16-F10 com doxiciclina, considerado inibidor seletivo de metaloproteinases, aumenta a viabilidade celular in vitro, inibe a atividade gelatinolítica da MMP-9, além de promover, no modelo in vivo, redução da expressão de MMP-14 e CD44, sem alterações consideráveis da expressão de CD44-ICD e MMP-9, além de aumentar o desenvolvimento de metástases pulmonares, sem alteração considerável na proliferação celular, e reduzindo a função pulmonar em modelo experimental de células B16-F10.
Abstract
Melanoma is a highly metastatic neoplasm, with aggressive, invasive behavior and high
resistance to treatment. During its progression, the importance of extracellular matrix
remodeling via metalloproteinases has been demonstrated, facilitating processes such as
migration, invasion and metastasis formation. Matrix metalloproteinases MMPs interact with
adhesion molecules, such as CD44, promoting their cleavage, generating the intracytoplasmic
domain (ICD) that is translocated to the nucleus, activating the transcription of genes related to
migration, invasion and tumor implantation. Hence, the CD44 cleavage inhibition through
metalloproteinase blockage, could function as a possible target for inhibition of tumor
progression and metastasis. Thus, this work aimed to investigate the effects of
metalloproteinase inhibition from the use of doxycycline on melanoma progression in the
murine model. B16-F10 cells grown under normal conditions and treated with 1, 5 and 10 μM
of doxycycline for 24 hours were used. Viability was evaluated by the MTT assay, followed by
migration, invasion, cell cycle and zymography assays. For the in vivo assay, cells were treated
and inoculated into 10-week-old female C57BL/6 mice via the tail vein. After 21 days, the
animals were anesthetized and lung function was evaluated by spirometry, later they were
euthanized and the lung collected for histopathological and immunohistochemical evaluation
of metastases. The results to date showed that doxycycline induced an increase in the viability
of B16-F10 cells, with significant results at 24 hours and 48 hours in the 10μM treated group,
compared to the control and 1μM treated groups (p<0.05 and p<0.01 respectively). The analysis
of gelatinolytic capacity indicated a reduction in MMP-9 activity at a concentration of 1 μM in
24 hours and inhibition at a concentration of 10 μM in 24 and 48 hours (p<0.01; p<0.001
respectively).The analysis of lung mechanics during the formation of metastases revealed a
reduction in the levels of FVC, Cdyn and FEV100 in the groups treated with 10 μM when
compared to the control (p<0.05). The lung areas affected by metastases in the animals treated
with 1 μM and 10 μM of doxycycline were larger than those of the control animals (p<0,05).
Immunohistochemistry revealed a lower expression of MMP-14 and CD44 in cases treated with
doxycycline when compared to the control (p<0.0001), with no relevant changes in the
expression of CD44-ICD (p<0.0001) and a decrease in the expression of MMP-9. Furthermore,
a relationship was observed between the CDC47 proliferative index and the area affected by
metastases (r=0.9505; p<0,05) and expression of MMP-9 and 14 (r=0.7959; r=0.814
respectively). Our data suggest that in vitro treatment of B16-F10 cells with doxycycline,
considered a selective inhibitor of metalloproteinases, increases cell viability, inhibits the
gelatinolytic activity of MMP-9, and promotes, in the in vivo model, a reduction in MMP-14
and CD44, without considerable changes in CD44-ICD and MMP-9, increases the development
of lung metastases and reduces lung function in an experimental model of B16-F10 cells.
Assunto
Patologia, Melanoma, Metástase Neoplásica, Doxiciclina
Palavras-chave
Melanoma, Doxiciclina, Progressão neoplásica, Metástase pulmonar
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