Estudo pré-clínico dos fármacos letrozol e pamidronato como alternativas terapêuticas para tratamento da leishmaniose visceral humana
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
Descrição
Tipo
Tese de doutorado
Título alternativo
Primeiro orientador
Membros da banca
Bruno Mendes Roatt
Edward José de Oliveira
Juliana Carvalho Tavares
Marta Marques Gontijo de Aguiar
Edward José de Oliveira
Juliana Carvalho Tavares
Marta Marques Gontijo de Aguiar
Resumo
A leishmaniose visceral (LV) é uma doença infecciosa causada, no Brasil, pela espécie
Leishmania (Leishmania) infantum e, atualmente, não existem vacinas e/ou terapias
profiláticas para a LV em humanos, sendo as abordagens farmacológicas atualmente
utilizadas, oriundas do processo de reposicionamento de fármacos. Neste contexto, o objetivo
do presente trabalho foi realizar estudo pré-clínico dos fármacos anticâncer letrozol (LET) e
pamidronato (PAM), visando identificar novas opções terapêuticas para tratamento da LV
humana. A atividade antileishmania, in vitro, dos fármacos foi avaliada por meio das atividades
antipromastigota e antiamastigota de L. infantum, com avaliação da citotoxicidade celular e
produção de óxido nítrico (NO), por 72 horas. No contexto ex vivo, as atividades antileishmania
e imunomoduladora dos fármacos foram avaliadas utilizando-se leucócitos do sangue
periférico humano, que foram incubados com L. infantum, e com LET e PAM, por 6 horas. A
atividade antileishmania foi avaliada em monócitos clássicos e não clássicos, e neutrófilos
ativados e não ativados. Também, aspectos fenotípicos-funcionais foram avaliados nas
subpopulações de monócitos e neutrófilos, bem como linfócitos T CD8- e CD8+ e B. O potencial
antileishmania de LET e PAM in vivo foi avaliado por meio da quantificação da carga
parasitária do baço e fígado, em camundongos Balb/c infectados com L. infantum, e a
atividade imunomoduladora foi avaliada por meio da quantificação de citocinas séricas. A
análise dos resultados in vitro mostrou que ambos os fármacos apresentaram atividade
antipromastigota, observando-se formação de vacúolos no citoplasma das promastigotas,
bem como alteração na morfologia do cinetoplasto e mitocôndria. Foi observado que LET e
PAM promoveram redução tanto da quantidade de macrófagos infectados quanto das
amastigotas intracelulares, de maneira concentração dependente. Não foi observada
produção de NO, e nas condições avaliadas, LET e PAM, apresentaram viabilidade celular
acima de 70%. Pelo modelo ex vivo utilizado, usando leucócitos humanos, LET e PAM
promoveram redução das formas internalizadas de L. infantum na subpopulação de monócitos
clássicos. A caracterização fenotípica das subpopulações de monócitos e neutrófilos
evidenciou que o tratamento promoveu aumento da expressão de HLA-DR nos monócitos, e
a expressão dos receptores do tipo Toll (TLR) 2 foi elevada e de TLR-4 reduzida, em todos os
tratamentos, na subpopulação de monócitos clássicos. Também não foi observada produção
de NO por esta metodologia. LET e PAM promoveram aumento de IL-12, e redução de IL-10
e TGF-β, pelos monócitos e neutrófilos. Foi demonstrado aumento de IFN- pelos linfócitos T
CD8- e CD8+
, e de TNF pelos linfócitos B, bem como redução de IL-10 pelas subpopulações
de linfócitos avaliadas. E por meio das análises de microscopia eletrônica de transmissão, foi
possível sugerir que LET e PAM promovem danos às amastigotas intracelulares. Os
resultados in vivo mostraram que LET na dose de 2,0 mg/Kg e PAM a 10,0 mg/Kg promoveram
redução da carga parasitária do fígado. Diante dos resultados obtidos, demonstramos que
LET e PAM podem ser elegíveis para avaliação como potenciais alternativas terapêuticas e/ou
como protótipos para tratamento da leishmaniose visceral humana.
Abstract
Visceral leishmaniasis (VL) is an infectious disease caused in Brazil by the species Leishmania
(Leishmania) infantum and, currently, there are no vaccines and/or prophylactic therapies for
VL in humans, and the pharmacological approaches currently used, originating from the
process drug repositioning. In this context, the objective of the present study was to carry out
a preclinical study of the anticancer drugs letrozole (LET) and pamidronate (PAM), aiming to
identify new therapeutic options for the treatment of human VL. The antileishmania activity of
the drugs in vitro was evaluated by means of the antipromastigote and antiamastigote activities
of L. infantum, with evaluation of cell cytotoxicity and production of nitric oxide (NO), for 72
hours. In the ex vivo context, the antileishmania and immunomodulatory activities of the drugs
were evaluated using leukocytes from human peripheral blood, which were incubated with L.
infantum, and with LET and PAM, for 6 hours. Antileishmania activity was evaluated in classic
and non-classic monocytes and activated and non-activated neutrophils. Also, phenotypic functional aspects were evaluated in monocyte and neutrophil subpopulations, as well as CD8-
and CD8+ and B lymphocytes. The antileishmania potential of LET and PAM in vivo was
evaluated by quantifying the parasitic load of the spleen and liver, in Balb/c mice infected with
L. infantum, and immunomodulatory activity was assessed by quantifying serum cytokines.
The analysis of the results in vitro showed that both drugs showed antipromastigote activity,
observing the formation of vacuoles in the cytoplasm of the promastigotes, as well as changes
in the morphology of the kinetoplast and mitochondria. It was observed that LET and PAM
reduced both the number of infected macrophages and the intracellular amastigotes, in a
concentration-dependent manner. NO production was not observed, and in the evaluated
conditions, LET and PAM, presented cell viability above 70%. By the ex vivo model used, using
human leukocytes, LET and PAM reduced the internalized forms of L. infantum in the
subpopulation of classic monocytes. The phenotypic characterization of monocyte and
neutrophil subpopulations showed that the treatment promoted an increase in the expression
of HLA-DR in monocytes, and the expression of Toll-like receptors (TLR) 2 was high and that
of TLR-4, in all treatments, in the subpopulation of classic monocytes. Nor was NO production
observed by this methodology. LET and PAM promoted an increase in IL-12, and a reduction
in IL-10 and TGF-β, by monocytes and neutrophils. An increase in IFN- by CD8- and CD8+ T lymphocytes, and TNF by B-lymphocytes was demonstrated, as well as a reduction in IL-10
by the evaluated lymphocyte subpopulations. And through transmission electron microscopy
analyzes, it was possible to suggest that LET and PAM promote damage to intracellular
amastigotes. The in vivo results showed that LET at 2.0 mg/kg and PAM at 10.0 mg/kg
promoted a reduction in the parasitic burden of the liver. In view of the results obtained, we
demonstrated that LET and PAM may be eligible for evaluation as potential therapeutic
alternatives and/or as prototypes for the treatment of human visceral leishmaniasis.
Assunto
Farmacologia, Leishmaniose visceral, Reposicionamento de medicamentos
Palavras-chave
Leishmaniose visceral humana, Reposicionamento de fármacos, Letrozol, Pamidronato