Disruption of multiple copies of the Prostaglandin F2alpha synthase gene affects oxidative stress response and infectivity in Trypanosoma cruzi
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Artigo de periódico
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A interrupção de múltiplas cópias do gene da prostaglandina F2alfa sintase afeta a resposta ao estresse oxidativo e a infectividade em Trypanosoma cruzi
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Resumo
A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi , é uma grave doença parasitária crônica, atualmente tratada com Nifurtimox (NFX) e Benznidazol (BZ). Além da alta toxicidade, esses fármacos apresentam baixa eficácia terapêutica, especialmente na fase crônica da doença. A existência de cepas de T. cruzi resistentes a medicamentos e a ocorrência de resistência cruzada entre BZ e NFX também já foram descritas. Nesse contexto, torna-se urgente estudar o metabolismo desses fármacos em T. cruzi para melhor compreender os mecanismos de resistência. A prostaglandina F2α sintase (PGFS) é uma enzima que tem sido correlacionada com a resistência do parasita ao BZ, mas o mecanismo pelo qual a resistência ocorre ainda não está claro. Nossos resultados mostram que o genoma do clone CL Brener de T. cruzi contém cinco sequências de PGFS e três pseudogenes potenciais . Utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9, geramos linhagens celulares knockout nas quais todas as sequências de PGFS foram interrompidas, conforme demonstrado por análises de PCR e Western blotting. A deleção de PGFS não alterou o crescimento dos parasitas nem sua susceptibilidade ao BZ e NFX quando comparada aos parasitas selvagens (WT). Curiosamente, observou-se que os transcritos de NTR-1 estavam superexpressos nos mutantes ΔPGFS. Além disso, os parasitas ΔPGFS apresentaram tolerância 1,6 a 1,7 vezes menor ao estresse oxidativo induzido pela menadiona, níveis mais baixos de corpos lipídicos do que os parasitas controle durante a fase estacionária e menor infectividade do que os parasitas controle.
Abstract
Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is a serious chronic parasitic disease, currently treated with Nifurtimox (NFX) and Benznidazole (BZ). In addition to high toxicity, these drugs have low healing efficacy, especially in the chronic phase of the disease. The existence of drug-resistant T. cruzi strains and the occurrence of cross-resistance between BZ and NFX have also been described. In this context, it is urgent to study the metabolism of these drugs in T. cruzi, to better understand the mechanisms of resistance. Prostaglandin F2α synthase (PGFS) is an enzyme that has been correlated with parasite resistance to BZ, but the mechanism by which resistance occurs is still unclear. Our results show that the genome of the CL Brener clone of T. cruzi, contains five PGFS sequences and three potential pseudogenes. Using CRISPR/Cas9 we generated knockout cell lines in which all PGFS sequences were disrupted, as shown by PCR and western blotting analyses. The PGFS deletion did not alter the growth of the parasites or their susceptibility to BZ and NFX when compared to wild-type (WT) parasites. Interestingly, NTR-1 transcripts were shown to be upregulated in ΔPGFS mutants. Furthermore, the ΔPGFS parasites were 1.6 to 1.7-fold less tolerant to oxidative stress generated by menadione, presented lower levels of lipid bodies than the control parasites during the stationary phase, and were less infective than control parasites.
Assunto
Trypanosoma cruzi, Nifurtimox, Dinoprosta, Estresse oxidativo, Doença de chagas, Resistência a medicamentos
Palavras-chave
Parasitic diseases, Trypanosoma cruzi, Cloning, Epimastigotes, Lipids, Oxidative stress, Genomics, Polymerase chain reaction
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https://journals.plos.org/plosntds/article?id=10.1371/journal.pntd.0010845