Efeito da adição do fulerol ao meio de maturação in vitro de oócitos bovinos
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
Descrição
Tipo
Dissertação de mestrado
Título alternativo
Effect of fullerenol addition to the in vitro maturation media of bovine oocytes
Primeiro orientador
Membros da banca
Letícia Zoccolaro Oliveira
Mariana Machado Neves
Mariana Machado Neves
Resumo
O estresse oxidativo é a principal causa de baixa eficiência na maturação de oócitos e no
desenvolvimento embrionário in vitro de embriões bovinos. Isso ocorre devido a um desbalanço
entre a quantidade de espécies reativas de oxigênio (EROs) e antioxidantes. O ambiente in vitro
possui alta tensão de oxigênio que, associada a outros fatores como a interferência da luz, presença
de espermatozoide e ausência de antioxidantes maternos, leva à maior produção de EROs, se
comparado ao ambiente in vivo. No presente experimento, foi avaliado o efeito da adição de fulerol
em diferentes concentrações ao meio de maturação in vitro de oócitos bovinos (MIV) sobre as
taxas de produção e qualidade dos embriões produzidos. O fulerol é reconhecido como um potente
antioxidante, uma molécula muito eletronegativa, estável, e capaz de alcançar locais específicos.
Foram utilizados quatro meios MIV: Grupo 1 – controle (CO) (n=461 oócitos): meio TCM 199
bicarbonato; Grupo 2 (F1) (n=461): meio TCM 199 bicarbonato acrescido de fulerol a 1nM; Grupo
3 (F10) (n=439): meio TCM 199 bicarbonato acrescido de fulerol a 10nM; Grupo 4 (F50) (n=451):
meio TCM 199 bicarbonato acrescido de fulerol a 50nM. Os oócitos foram maturados em
incubadora por 24 horas a 38,5oC, 5% de CO2 e 95% de umidade. Posteriormente, foram
fertilizados e cultivados em mesmo meio de fertilização e cultivo, respectivamente. No segundo
dia de cultivo (D2), foi avaliada a taxa de clivagem e no sétimo dia de cultivo (D7) foram avaliadas
a taxa de produção de blastocistos sobre os embriões clivados e a taxa de produção de blastocistos
sobre o total de oócitos maturados. Além disso, após observação e definição dessas taxas, os
embriões produzidos foram fixados para avaliação de apoptose celular pelo método de TUNEL.
Os oócitos foram avaliados quanto à maturação nuclear pelo método de Hoechst. Não houve
diferença estatística (P>0,05) nas taxas de clivagem (73,96%; 73,53%; 73,12%; 76,94%) para T1;
F1; F10 e F50, respectivamente. A produção de blastocistos diferiu (P<0,05) entre os tratamentos.
CO, F1 e F50 demonstraram resultados estatisticamente semelhantes (P>0,05) (CO=30,15%;
F1=27,11%; F50=31,04%). CO e F50 obtiveram resultados superiores (P<0,05) a F10 (23,91%),
que não diferiu (P>0,05) do F1. O número total de células por embrião (CO=130,84; F1=129,78;
F10=110,72; F50=134,05) e o número total de células apoptóticas (CO=8,52; F1=7,68; F10=7,54;
F50=5,85) não diferiram (P>0,05) entre os tratamentos. A taxa de apoptose foi superior (P<0,05)
no CO (7,43%) em relação a F50 (4,23%). CO, F1 (5,94%) e F10 (6,98%) não diferiram (P>0,05),
assim como F1, F10 e F50 foram estatisticamente iguais (P>0,05). Não houve diferença (P>0,05)
entre a taxa de oócitos maturados (Metáfase II) entre os tratamentos (CO=53,3%; F1=48,2%;F10=48,0%; F50=33,3%). Conclui-se que a presença de fulerol no meio MIV não interferiu nas
taxas maturação dos oócitos e de clivagem, porém reduziu a produção de blastocistos em meio na
concentração de 10nM de fulerol. Na concentração de 50nM de fulerol os resultados de clivagem
e produção de blastocistos foram iguais às do grupo controle, porém reduziu a taxa de apoptose,
quando comparado com o esse mesmo grupo.
Abstract
Oxidative stress is the main cause of low efficiency in oocyte maturation and embryo development
in in vitro embryo production, due to an imbalance between the amount of reactive oxygen species
(ROS) and antioxidants. The in vitro atmosphere has a high oxygen tension, which associated with
other factors such as light interference, presence of sperm and absence of maternal antioxidants
lead to a higher production of ROS, when compared to the in vivo atmosphere. The present study
was aimed to evaluate the effect of the addition of fullerenol, in distinct concentrations to the in
vitro maturation media of bovine oocytes (IVM), on the production rates and quality of the
embryos produced. Fullerenol is recognized as a powerful antioxidant, a very electronegative and
stable molecule that is able to reach to specific targets. Four distinct IVM media were tested: group
1 – control (CO) (n=461 oocytes): TCM 199 bicarbonate media; group 2 (F1) (n=461): TCM 199
bicarbonate media with 1nM of fullerenol; group 3 (F10) (n=439): TCM 199 bicarbonate media
with 10nM of fullerenol; group 4 (F50) (n=451): TCM 199 bicarbonate media with 50nM of
fullerenol. Oocytes were matured in incubator during 24 hours at 38oC, 5% of CO2 and humidity
of 95%. Subsequently, the oocytes were fertilized and cultivated in the same media of fertilization
and cultivation, respectively. On the second day of culture (D2) the cleavage rate was evaluated,
and on the seventh day (D7) the blastocyst rate by the total of cleavage embryos and the rate of
blastocyst production by the total number of matured oocytes were evaluated. In addition, after
observation and definition of those rates, embryos produced were fixed for posterior TUNEL
assay. Nuclear maturation was evaluated by meiotic status at the end of oocyte maturation using
HOECHST staining. There were no statistical difference (P>0.05) between cleavage rates
(73.96%; 73.53%; 73.12%; 76.94%) for CO, F1, F10 and F50, respectively. Blastocyst rate
differed between treatments. CO, F1 and F50 showed statistically similar (P>0.05) results
(CO=30.15%, F1=27.11%, F50=31.04%). CO and F50 had higher (P<0.05%) blastocyst
production than F10 (23.91%), which was equal to F1. The total number of cells per embryo
(CO=130.84, F1=129.78, F10=110.72, F50=134.05) and the total number of apoptotic cells
(CO=8.52, F1=7.68, F10=7.54, F50=5.85) did not differ (P>0.05) between treatments. The
apoptosis rate was higher (P<0.05) in CO (7.43%) than F50 (4.23%). CO, F1 (5.94%) and F10
(6.98%) did not differ (P>0.05), as F1, F10 and F50 were statistically similar (P>0.05). Nuclear
maturation (metaphase II) did not differ (P>0.05) between treatments (CO=53.3%; F1=48.2%;
F10=48.0%; F50=33.3%). In conclusion, the presence of fullerenol in the IVM media had no effect on nuclear maturation rate and the cleavage rate, while reduced the blastocyst production at 10nM
concentration. In high concentration of fullerenol (50nM), cleavage and blastocyst production
were similar (P>0.05) to the control group, however reduced apoptosis rate when compared to the
same treatment.
Assunto
Palavras-chave
Reprodução animal, Oocito, Bovino embriões