Avaliação do potencial imunoterapêutico e imunoprofilático de formulações contendo antígenos de Leishmania infantum associados a antígenos de Lutzomyia longipalpis contra a leishmaniose visceral canina
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Tese de doutorado
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Resumo
A leishmaniose visceral é uma grave doença causada por protozoários do gênero Leishmania. Os cães são conhecidos por serem os reservatórios domésticos do parasito, e se infectam durante o repasto sanguíneo de insetos fêmeas dos gêneros Lutzomyia e Phlebotomus. No Brasil a espécie Leishmania infantum (sinonímia Leishmania chagasi) é a principal responsável por causar a leishmaniose visceral canina (LVC). Atualmente, o controle e o tratamento da doença apresentam muitas falhas. Diante das limitações é de extrema importância o desenvolvimento de novas alternativas eficazes no tratamento e profilaxia da LVC. A imunoterapia, bem como, a vacinação são estratégias relevantes. O objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial terapêutico e profilático de formulações compostas por antígenos de L. infantum e Lutzomyia longipalpis. Para isso, nesse trabalho foram realizados ensaios clínicos, em cães naturalmente infectados por L. infantum, e pré-clínicos, utilizando hamsters e camundongos. Os cães e hamsters, foram usados para os ensaios imunoterapêuticos, enquanto os camundongos foram avaliados em ensaios pré-clínicos vacinais. No ensaio clínico em cães, a formulação imunoterapêutica compreendeu a proteína L22.4_CHP associada ao antígeno do vetor e ao adjuvante saponina. O esquema imunoterapêutico realizado contou seis doses das formulações, via subcutânea, com intervalo de 15 dias entre cada dose. Os cães receberam 100µg da proteína associada à 2x10-11 TU do fago e 300µg do adjuvante saponina por dose. Já no ensaio imunoterapêutico pré-clínico, o esquema terapêutico foi semelhante ao clínico, porém as doses consistiram em 50µg das proteínas recombinantes P1 ou P3, associadas à 50µg de saponina ou Montanide na proporção de 60% da dose. Para esse ensaio, os hamsters foram infectados com 107 promastigotas de L. infantum em fase estacionária. O tratamento começou dois meses após a infecção e, a eutanásia, ocorreu 30 dias após o fim do tratamento. Em relação ao protocolo vacinal, as formulações iguais aquelas usadas no protocolo pré-clínico de imunoterapia. O esquema vacinal utilizado foi de 3 doses, via subcutânea, com intervalo de 15 dias entre as doses, sendo que metade dos animais foram eutanasiados ao fim do protocolo e a outra metade foi infectada com 107 promastigotas de L. infantum, em fase estacionária, 15 dias depois. A eutanásia desses animais ocorreu 30 dias após a infecção. Os principais resultados obtidos, mostram que em todos os modelos avaliados os imunobiológicos utilizados foram seguros, não causando alterações nos parâmetros hematológicos e bioquímicos, assim como, não apresentando efeitos adversos graves. Além disso, apresentaram alta antigenicidade, produzindo elevados níveis de IgG total contra os antígenos das formulações testadas, bem como contra antígenos de L. infantum. No protocolo vacinal também foi observado aumento de células T CD4+ e T CD8+, com indução concomitante de IgG1 e IgG2a, indicando uma resposta imune mista do tipo 1 e 2. Estes resultados corroboram com os achados parasitológicos que demonstraram nos camundongos uma redução significativa da carga parasitária no grupo vacinado com a proteína P3 associada ao adjuvante saponina. Nos cães, o tratamento imunoterapêutico foi capaz de induzir melhora dos sinais clínicos, com redução da carga parasitária para níveis praticamente indetectáveis, enquanto nos hamster, o tratamento demonstrou tendência de diminuição da carga parasitária no baço e fígado (especialmente para a proteína P1 associada ao adjuvante saponina ou montanide). Em relação ao bloqueio da ligação de L. infantum em células Lulo, foi observada tendência de redução da ligação do parasito induzida pela formulação imunoterápica testada em cães, assim como no estudo vacinal em camundongos para as formulações P1SAP, P1MONT e P3MONT. Logo, foi possível concluir que em conjunto, os dados indicam que os imunobiológicos avaliados têm potencial como vacina e imunoterapia contra a leishmaniose visceral.
Abstract
Visceral leishmaniasis is a severe disease caused by protozoa of the Leishmania genus. Dogs
are known to be the domestic reservoirs of the parasite, becoming infected during the blood
meal of female sandflies from the Lutzomyia and Phlebotomus genera. In Brazil, the species
Leishmania infantum (synonym Leishmania chagasi) is primarily responsible for causing
canine visceral leishmaniasis (CVL). Currently, the control and treatment of the disease present
several challenges. Given these limitations, the development of new, effective alternatives for
the treatment and prophylaxis of CVL is of utmost importance. Immunotherapy, as well as
vaccination, are relevant strategies. The aim of this study was to evaluate the therapeutic and
prophylactic potential of formulations composed of antigens from L. infantum and Lutzomyia
longipalpis. To this end, clinical trials were conducted on dogs naturally infected with L.
infantum, and preclinical trials were performed using hamsters and mice. The dogs and
hamsters were used in immunotherapy trials, while mice were evaluated in preclinical vaccine
trials. In the clinical trial with dogs, the immunotherapeutic formulation included the
L22.4_CHP protein combined with the vector antigen and the adjuvant saponin. The
immunotherapy regimen consisted of six doses of the formulation, administered
subcutaneously, with a 15-day interval between each dose. The dogs received 100μg of the
protein associated with 2x10⁻¹¹ TU of phage and 300μg of saponin per dose. In the preclinical
immunotherapy trial, the therapeutic regimen was similar to the clinical one, but the doses
consisted of 50μg of recombinant P1 or P3 proteins, associated with 50μg of saponin or
Montanide at 60% of the dose. For this trial, the hamsters were infected with 10⁷ L. infantum
promastigotes in the stationary phase. Treatment began two months after infection, and
euthanasia occurred 30 days after treatment completion. Regarding the vaccination protocol,
the formulations used were the same as those used in the preclinical immunotherapy protocol.
The vaccination schedule consisted of 3 doses, administered subcutaneously, with a 15-day
interval between doses. Half of the animals were euthanized at the end of the protocol, and the
other half was infected with 10⁷ L. infantum promastigotes in the stationary phase, 15 days later.
Euthanasia for these animals occurred 30 days post-infection. The main results obtained showed
that in all the models evaluated, the immunobiologics used were safe, not causing alterations in
hematological and biochemical parameters, and not presenting any severe adverse effects.
Furthermore, they exhibited high antigenicity, producing elevated levels of total IgG against
the antigens of the tested formulations as well as against L. infantum antigens. In the vaccination
protocol, an increase in CD4+ and CD8+ T cells was also observed, with a concurrent induction
of IgG1 and IgG2a, indicating a mixed type 1 and 2 immune response. These results
corroborated the parasitological findings, which demonstrated a significant reduction in
parasitic load in the vaccinated mice group treated with the P3 protein associated with saponin
adjuvant. In dogs, the immunotherapeutic treatment was able to improve clinical signs, with a
reduction in parasitic load to nearly undetectable levels, while in hamsters, the treatment
showed a trend toward decreased parasitic load in the spleen and liver (especially for the P1
protein associated with saponin or Montanide adjuvant). Regarding the inhibition of L. infantum
binding to Lulo cells, a trend toward reduced parasite binding was observed in the
immunotherapeutic formulation tested in dogs, as well as in the vaccine study in mice for the
P1SAP, P1MONT, and P3MONT formulations. Therefore, it was concluded that collectively,
the data indicate that the evaluated immunobiologics have potential as both a vaccine and
immunotherapy for visceral leishmaniasis.
Assunto
Biologia Celular, Leishmaniose Visceral, Imunoterapia, Vacinação, Proteínas Recombinantes
Palavras-chave
Leishmaniose visceral canina, Imunoterapia, Vacinação, Proteína recombinante