Mecanismos de secreção de eosinófilos: compartimentalização e tráfego vesicular de sintaxina-17, CD63 e interferon-gama
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Tese de doutorado
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Membros da banca
Gleydes Gambogi Parreira
Alexandre de Paula Rogério
Thiago Pereira da Silva
Vanessa Pinho da Silva
Alexandre de Paula Rogério
Thiago Pereira da Silva
Vanessa Pinho da Silva
Resumo
Os eosinófilos são leucócitos do sistema imune inato, capazes se secretar
inúmeras moléculas que são armazenadas pré-formadas dentro de seus grânulos
secretores (específicos). Essa secreção pode ocorrer por: (i) desgranulação por
piecemeal (PMD), mediada por vesículas, principalmente carreadores de grande
porte conhecidos como vesículas sombrero (EoSVs) que brotam dos grânulos e
levam os produtos até a superfície celular; (ii) exocitose clássica, caracterizada por
fusão de grânulos individuais com a membrana plasmática; (iii) exocitose composta,
quando há fusão grânulo-grânulo antes da liberação extracelular e (iv) citólise,
deposição de grânulos intactos após a lise celular. Considerando que a atividade
funcional dos eosinófilos depende de sua capacidade secretora, o estudo dos
mecanismos de secreção, bem como das proteínas envolvidas e de seu tráfego
intracelular são importantes para o entendimento das respostas de eosinófilos
durante doenças alérgicas e inflamatórias. Uma proteína relacionada com secreção
de eosinófilos é o CD63, molécula da família das tetraespaninas, enquanto a
sintaxina-17 (STX17) é uma proteína SNARE envolvida na fusão de vesículas
durante a secreção constitutiva e potencialmente no transporte de cargas
especificas em células especializadas. A molécula de interferon-gama (IFN-γ) é
encontrada em grande quantidade em eosinófilos, com papel importante na resposta
inflamatória. Entretanto, o tráfego intracelular dessas proteínas e seu envolvimento
nos mecanismos de secreção de eosinófilos é desconhecido. Neste trabalho, foram
investigados a localização ultraestrutural e o tráfego intracelular das moléculas de
CD63, STX17 e IFN-γ em eosinófilos humanos estimulados ou não com os
mediadores inflamatórios CC-chemokine ligand 11- CCL11 e fator de necrose
tumoral -TNF-α). Em paralelo, foi verificada se eosinófilos humanos secretam
vesículas extracelulares (VEs), que podem estar associadas com respostas imunes.
Técnicas de microscopia eletrônica (convencional e imunomarcação
ultraestrutural/pre-embedding immunonanogold), além de citometria de fluxo e
western blotting foram utilizadas para responder essas questões. Primeiramente foi
demonstrado que a STX17 se localiza em grânulos e EoSVs em eosinófilos
humanos, as quais são estruturas fundamentais na secreção de eosinófilos. Foi
evidenciado também que o CD63 está fortemente associado com os processos de
secreção de eosinófilos (PMD e exocitose composta) e que as EoSVs atuam
translocando o CD63 de/para grânulos secretores. Em outras análises, demonstrouse
que o IFN-γ é localizado em grânulos secretores de eosinófilos humanos e pode
ser transportado em EoSVs para a periferia celular após a estimulação das células.
Interessantemente, verificou-se que eosinófilos humanos produzem microvesículas
(VEs produzidas diretamente da membrana plasmática) que essa produção é
aumentada quando estas células respondem a estímulos inflamatórios. Em
conclusão, nossos resultados levaram a importantes descobertas sobre a atividade
secretora de eosinófilos e de moléculas associadas à mesma, contribuindo para o
entendimento sobre as reações mediadas por eosinófilos frente a ambientes
inflamatórios.
Abstract
Eosinophils are able to release numerous mediators that are pre-synthesized
and stored within their cytoplasmic specific (secretory) granules. Secretion can occur
by: (i) piecemeal degranulation (PMD), characterized by vesicle-mediated transport
of products from granules to cell surface, involving mainly large carriers termed
Eosinophil Sombrero Vesicles (EoSVs); (ii) classical exocytosis, characterized by
fusion of individual granules with the plasma membrane; (iii) compound exocytosis,
characterized by large channels formed by granule–granule fusions before granule
content release and (iv) cytolysis, characterized by release of intact granules after
cell lysis. Considering that the functional activity of eosinophils is based on their
secretory capacity, the study of the molecules involved in eosinophil secretion, as
well as their intracellular trafficking is important to understand eosinophil responses
during allergic and inflammatory diseases. CD63, a tetraspanin family member, has
been associated to eosinophil granules and secretion. Syntaxin 17 (STX17), a
SNARE family molecule, is involved with vesicle fusion during constitutive secretion
and potentially in cargo transport within specialized cells. High levels of interferongamma
(IFN-γ), an important inflammatory cytokine, are constitutively expressed in
human eosinophils. However, the intracellular trafficking of these molecules and their
association with eosinophil secretory mechanisms remain to be established. In this
work, we investigated the ultrastructural localization and the intracellular trafficking of
CD63, STX17 and IFN-γ in human eosinophils stimulated or not with inflammatory
mediators (CC-chemokine ligand 11- CCL11 - e tumor necrosis fator alpha -TNF-α-).
Moreover, we investigated if human eosinophils can secrete extracellular vesicles
(EVs), that might be involved in inflammatory responses. Pre-embedding
immunonanogold and conventional transmission electron microscopy (TEM), flow
cytometer and western blotting techniques were used to investigate these questions.
First, our results showed that STX17 is localized on granules and EoSVs, important
structures involved in eosinophil secretory mechanisms. The data also demonstrated
that CD63 is strongly associated with eosinophil secretory processes (piecemeal
degranulation and compound exocytosis) and EoSVs are translocating CD63 to/from
granules. Results demonstrated that IFN-γ is localized on secretory granules and can
be translocated to cell periphery by EoSVs after eosinophil stimulation. In addition,
we demonstrated that human eosinophils can produce microvesicles and the number
of these extracellular vesicles increased after stimulation with CCL11 or TNF-a.
Altogether, our results shed light to eosinophil secretory mechanisms and their
associated molecules, leading to new insights to understand how eosinophil respond
to inflammatory conditions through vesicular trafficking of their granule contents
secretion.
Assunto
Eosinófilos, Tetraspanina 30, Interferon gama
Palavras-chave
Biologia celular
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