Characterization of the N-terminal of Tetracenomycin aromatase/cyclase interactions with intermediate and product analogs

Abstract

O N-terminal da Tetracenomicina aromatase/ciclase (TcmN) é uma enzima de Streptomyces glaucescens envolvida na ciclização e aromatização de policetídeos. Policetídeos aromáticos constituem uma importante classe de metabólitos secundários produzidos por certas bactérias, fungos e plantas, com diversas atividades biológicas. Exemplos incluem antibióticos, como as tetraciclinas, e fármacos anticâncer, como a doxorrubicina. Existem poucos ensaios experimentais que caracterizam a interação da TcmN com ligantes e, como a TcmN é uma enzima promissora para a produção in vitro de policetídeos, compreender o processo de reconhecimento molecular da enzima é fundamental para o entendimento de seu mecanismo catalítico. Este trabalho investiga o mecanismo de reconhecimento molecular da TcmN a substratos, intermediários e produtos, bem como o papel da dinâmica conformacional da TcmN em sua função enzimática. A TcmN foi produzida por expressão heteróloga. Dicroísmo circular (CD) e calorimetria diferencial de varredura (DSC) foram utilizados para avaliar a estabilidade térmica e temporal da enzima. A interação com ligantes foi estudada por experimentos de diferença de transferência de saturação em ressonância magnética nuclear (STD-RMN) de ¹H, perturbação de deslocamento químico por RMN de ¹H-¹⁵N, experimentos de relaxação em RMN de ¹⁵N e simulações de dinâmica molecular (MD) em escala de microssegundos. A temperatura de melting (Tm) da TcmN ligada à naringenina, medida por DSC, foi superior à da enzima livre. O sítio de ligação da naringenina, mapeado por experimentos de RMN, localizou-se na cavidade central da TcmN. Dinâmica conformacional na escala de μs–ms foi detectada por experimentos de relaxação em RMN para resíduos da TcmN na cavidade de ligação ao substrato quando ligada à naringenina. Duas conformações predominantes, representando estados de cavidade aberta e fechada, foram observados nas simulações de MD, e os resultados sugerem que a ligação de intermediários desloca a população conformacional da TcmN para o estado aberto. Os resultados fornecem insights sobre a base molecular do reconhecimento de substratos e auxiliam na elucidação do mecanismo catalítico da TcmN.