Minimização da formação de B-30 Destreonina Insulina durante a conversão enzimática da Proinsulina em insulina por Tripsinólise
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Dissertação de mestrado
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Resumo
O presente estudo visou o bloqueio efetivo de grupos ε-amino de resíduos de
Lisina em cadeia B de Insulina, Insulina e Proinsulina antes das conversões enzimáticas
ocasionadas pelo uso combinado de Tripsina e Carboxipeptidase B, limitando o sítio de
restrição dessas enzimas ao resíduo de Arginina e assim diminuindo substancialmente a
presença do intermediário B-30 Destreonina Insulina durante a produção industrial de
Insulina Humana.
A condições propostas são: 100:1 de reagente em relação à amostra em solução
tampão Glicina pH 9,0, à temperatura de 23°C com correção imediata do pH. As
conversões enzimáticas foram realizadas sob as condições supracitadas e a cada 2 horas
de conversão os produtos foram analisados por cromatografia de fase reversa HPLC e
espectrometria de massa MALDI-TOFMS/MSMS e Q-TOFMS.
A perfil full scan obtido por Maldi TOF detectou a diminuição dos íons relativos
à Proinsulina m/z 10633 e o aparecimento do íon m/z 5808 relativo à Insulina. A
presença do íon correspondente a B-30 Destreonina não foi verificada quando da análise
por Maldi TOF possivelmente pela supressão causada pelos demais íons da amostra em
conversão cuja intensidade relativa era alta. Quando analisados por Q-TOF, o perfil do
espectro apresentado para Proinsulina bloqueada e não bloqueada com 2,3
dimetilmaleico evidencia a diminuição da intensidade relativa dos íons multicarregados
m/z 1902 e 1427 referentes à m/z 5708 sugerindo a presença de B-30 Destreonina
Insulina. Como íon referência foi acompanhado a presença do íon de m/z 1256 relativa
ao componente cauda de Histidina e que mantém a intensidade relativa nas análises Q
TOF MS das amostras com e sem bloqueio de ε-amino corroborando com o tratamento
proposto para a minimização da formação do composto B-30 Destreonina Insulina.
Abstract
The present study was conducted at the effective blockade of ε-amino group of
lysine residues of chain B of Insulin, Insulin and Proinsulin before enzymatic
conversions caused by the combined use of Trypsin and Carboxypeptidase B limiting
the restriction site of these enzymes to Arginine residues and thus decreasing
substantially the presence of intermediate B-30 Destreonin Insulin during the industrial
production of human insulin.
The proposed conditions are: concentration of 100:1 reagent over the sample in
Glycine buffer pH 9,0, temperature 23°C with immediate correction of pH. The
enzymatic conversions were carried out under the above conditions and every two hours
of conversion the products were analyzed by reverse phase HPLC chromatography and
mass spectrometry MALDI-TOFMS/MSMS and Q-TOFMS.
The full scan profile obtained by Maldi TOF detected a reduction of the ions of
Proinsulin m/z 10633 and the increase of the ion m/z 5808 of Insulin. The presence of
the ion corresponding to B-30 Destreonin was not observed when the analysis was made
by Maldi TOF, possibly due to suppression caused by other ions in the sample
conversion whose relative intensity was high. When analyzed by Q-TOF, the
conversion profile of the spectrum presented Proinsulin blocked and not blocked with
2,3-dimetylmaleic shows the decrease in relative intensity of multicharger ions m/z
1902 and 1427 related to m/z 5707, suggesting the presence of B -30 Destreonina
Insulin. As reference ion was followed by the presence of m/z 1256 for the component
Histidine tail that keeps the relative intensity of the Q-TOF MS analysis of samples with
and without blocking ε-amino corroborating with the proposed treatment for
minimization of the formation of B-30 Destreonina Insulin compound.
Assunto
Bioquímica, Insulina, Proinsulina, Anidridos Maleicos
Palavras-chave
B-30 Destreonina Insulina, Insulina, Proinsulina, Conversão enzimática