Delivery of plasmid DNA by ionizable lipid nanoparticles to induce CAR expression in T cells
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Resumo
Introduction: Chimeric antigen receptor (CAR) cell therapy represents a hallmark in cancer immunotherapy, with significant clinical results in the treatment of hematological tumors. However, current approved methods to engineer T cells to express CAR use viral vectors, which are integrative and have been associated with severe adverse effects due to constitutive expression of CAR. In this context, non-viral vectors such as ionizable lipid nanoparticles (LNPs) arise as an alternative to engineer CAR T cells with transient expression of CAR. Methods: Here, we formulated a mini-library of LNPs to deliver pDNA to T cells by varying the molar ratios of excipient lipids in each formulation. LNPs were characterized and screened in vitro using a T cell line (Jurkat). The optimized formulation was used ex vivo to engineer T cells derived from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for the expression of an anti-CD19 CAR (CAR-CD19BBz). The effectiveness of these CAR T cells was assessed in vitro against Raji (CD19+) cells. Results: LNPs formulated with different molar ratios of excipient lipids efficiently delivered pDNA to Jurkat cells with low cytotoxicity compared to conventional transfection methods, such as electroporation and lipofectamine. We show that CAR-CD19BBz expression in T cells was transient after transfection with LNPs. Jurkat cells transfected with our top-performing LNPs underwent activation when exposed to CD19+ target cells. Using our top-performing LNP-9-CAR, we were able to engineer human primary T cells to express CAR-CD19BBz, which elicited significant specific killing of CD19+ target cells in vitro. Conclusion: Collectively, our results show that LNP-mediated delivery of pDNA is a suitable method to engineer human T cells to express CAR, which holds promise for improving the production methods and broader application of this therapy in the future.
Abstract
Introdução: A terapia celular com receptor de antígeno quimérico (CAR) representa uma marca registrada na imunoterapia do câncer, com resultados clínicos significativos no tratamento de tumores hematológicos. No entanto, os métodos aprovados atuais para projetar células T para expressar CAR usam vetores virais, que são integrativos e têm sido associados a efeitos adversos graves devido à expressão constitutiva de CAR. Nesse contexto, vetores não virais, como nanopartículas lipídicas ionizáveis (LNPs), surgem como uma alternativa para projetar células T CAR com expressão transitória de CAR. Métodos: Aqui, formulamos uma minibiblioteca de LNPs para fornecer pDNA às células T variando as proporções molares de lipídios excipientes em cada formulação. Os LNPs foram caracterizados e rastreados in vitro usando uma linhagem de células T (Jurkat). A formulação otimizada foi usada ex vivo para projetar células T derivadas de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) para a expressão de um CAR anti-CD19 (CAR-CD19BBz). A eficácia dessas células T CAR foi avaliada in vitro contra células Raji (CD19+). Resultados: LNPs formulados com diferentes proporções molares de lipídios excipientes entregaram eficientemente pDNA para células Jurkat com baixa citotoxicidade em comparação com métodos de transfecção convencionais, como eletroporação e lipofectamina. Mostramos que a expressão de CAR-CD19BBz em células T foi transitória após transfecção com LNPs. Células Jurkat transfetadas com nossos LNPs de alto desempenho passaram por ativação quando expostas a células-alvo CD19+. Usando nosso LNP-9-CAR de alto desempenho, fomos capazes de projetar células T primárias humanas para expressar CAR-CD19BBz, o que provocou morte específica significativa de células-alvo CD19+ in vitro. Conclusão: Coletivamente, nossos resultados mostram que a entrega de pDNA mediada por LNP é um método adequado para projetar células T humanas para expressar CAR, o que é promissor para melhorar os métodos de produção e a aplicação mais ampla desta terapia no futuro.
Assunto
Lipídeos, Nanopartículas, DNA, Engenharia celular, Neoplasias, Imunoterapia
Palavras-chave
Lipid nanoparticles, pDNA delivery, CAR T cells, Cell engineering, Cancer immunotherapy