Análise proteômica comparativa de linhagens celulares de melanoma e melanócito murinos frente ao tratamento com fração proteolítica derivada do látex de Vasconcellea cundinamarcensis
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Tese de doutorado
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Resumo
Estudos prévios mostraram que a fração proteolítica CMS-2, obtida do látex de Vasconcellea cundinamarcensis, diminui significativamente o número de metástases em animais portadores de carcinoma de cólon e melanoma, mostrando, in vitro, aumento da fragmentação de DNA e diminuição da adesão e da invasão celulares. Neste trabalho, apresentamos a análise proteômica de lisados celulares de melanoma metastático B16-F10 e melanócito Melan-a, ambos murinos, tratados com CMS-2 (10 µg/mL, 24h), com o intuito de identificar a modulação de proteínas que estejam relacionadas com o desenvolvimento tumoral e/ou metastático. Utilizando eletroforese bidimensional DIGE e espectrometria de massas foi possível identificar 71 spots diferentemente expressos entre os controles Melan-a (MC) e B16-F10 (BC). Quando MC e BC são comparados com os seus respectivos grupos tratados, Melan-a (MT) e B16-F10 (BT), observou-se alteração seletiva, em B16-F10, dos níveis de expressão de 21 spots. CMS-2 reverteu, a valores comparáveis à MC, 4 proteinas super expressas em BC, Nucleofosmina 1; Proteína de choque térmico 65, Proteína ligante a calciclina e Fator de iniciação da tradução eucariótica 4H, que participam da proliferação, sobrevivência, invasão e da migração celular. A fração CMS-2 promoveu a super expressão de enzimas glicolíticas e antioxidantes, efeito que pode estar relacionado à redução da fosforilação oxidativa, determinada pela metabolização da resazurina, e à indução de melanogênese, marcador de diferenciação, avaliada pelo aumento do conteúdo de melanina/atividade de tirosinase. A redução da expressão de cofilina 1 e de actina β e γ, proteínas envolvidas com a motilidade celular, podem justificar a inibição da migração de B16-F10 e de Melan-a verificada após esse tratamento. A redução, ainda que parcial, de ciclofilina A, proteína precursora de dissulfeto isomerase A3 e calreticulina, chaperonas super expressas em células tumorais, e do inibidor da dissociação de guanosina difosfato 2, que em altos níveis promove a transição epitélio mesenquimal e impede a ativação de caspases, também corrobora os efeitos celulares de CMS-2. Assim, conclui-se que CMS-2 é capaz de reverter a expressão de proteínas relacionadas à progressão tumoral e desenvolvimento de metástases em B16-F10, comparáveis aos padrões de expressão em linhagem normal melanocítica. Tal efeito justifica a atividade antimetastática da fração e auxilia no esclarecimento do(s) seu(s) mecanismo(s) de ação, fundamentando o seu possível uso terapêutico.
Abstract
Previous studies showed that CMS-2 proteolytic fraction, obtained from the
Vasconcellea cundinamarcensis latex, significantly reduced the number of
metastasis in animals bearing colon carcinoma and melanoma, and in vitro,
increased DNA fragmentation and decreased adhesion and cell invasion. Here, we
present a proteomic analysis of cell lysates from metastatic melanoma B16-F10 and
melanocyte Melan-a, both murine, treated with CMS-2 (10 μg/mL, 24 h), in order to
identify modulated proteins related to tumor and/or metastatic development. Using
the techniques of two-dimensional electrophoresis DIGE and mass spectrometry, it
was possible to identify 71 spots differently expressed between controls - Melan-a
(MC) and B16-F10 (BC). When MC and BC are compared to their respectives treated
groups, Melan-a (MT) and B16-F10 (BT), selective effects, on B16-F10, were
observed in 21 spots expression levels. CMS-2 statistically reduced the expression
of 4 proteins (nucleophosmin 1, heat shock protein 65, calcyclin binding protein and
eukaryotic translation initiation factor 4H), overexpressed in BC, to similar levels of
MC. These proteins are related to the proliferation, survival, migration and cell
invasion. The antioxidant and glycolytic enzymes superexpression, after exposure to
CMS-2, was observed and may be related to the oxidative phosphorylation reduction,
as determined by the resazurin metabolism, and melanogenesis induction
(differentiation marker), measured by content of melanin and tyrosinase activity. The
decreased expression of actin- β and γ and cofilin 1, proteins involved in cell motility,
may explain the reduction of B16-F10 and Melan-a cell migration observed after
CMS-2 treatment. The reduction, even partially, of cyclophilin A, protein disulfide
isomerase A3 precursor and calreticulin precursor, chaperones superexpressed in
tumor cells, and guanosine diphosphate (GDP) dissociation inhibitor 2, which at high
levels promote epithelial mesenchymal transition and prevents the activation of
caspases, may also justify the cellular effects observed in the presence of CMS-2. In
conclusion, CMS-2 can reverse the protein expression, in B16-F10 cells, related to
tumor progression and metastasis to normal melanocytic line patterns. This effect
justifies the CMS-2 antimetastatic activity and supports in clarifying the
mechanism(s) of action.
Assunto
Farmacologia, Proteômica, Melanoma, Melanócitos, Látex
Palavras-chave
Cisteíno proteases, Antimetastático, Proteoma, Melanoma, Migração celular, Melanogênese
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