Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1843/34636
Type: Tese
Title: Evaluation of the LyeTx I-b synthetic peptide derived from spider venom as a potential antitumoral prototype: pharmacological and toxicological studies
Other Titles: Avaliação do peptídeo sintético LyeTx I-b derivado do veneno de aranha como um potencial protótipo antitumoral: estudos toxicológicos e farmacológicos
Authors: Mostafa Abdellatif Abdelsalam Abdelrheem
First Advisor: Elaine Maria de Souza Fagundes
First Co-advisor: Juliana Carvalho Tavares
metadata.dc.contributor.advisor-co2: Maria Elena de Lima Perez Garcia
First Referee: Elaine Maria de Souza Fagundes
Second Referee: Juliana Carvalho Tavares
Third Referee: Enio Ferreira
metadata.dc.contributor.referee4: Antônio Carlos Pinheiro de Oliveira
Abstract: Antimicrobial peptides present a broad spectrum of therapeutic applications, including their use as anticancer peptides. These peptides have as a target microbial, normal and cancerous cells. In this work we demonstrate for the first time the cytotoxic effects of the cationic alpha-helical antimicrobial peptide LyeTx I-b on glioblastoma lineage U87-MG. The anticancer property of this peptide was associated with a membranolytic mechanism in U87- MG. Loss of membrane integrity occurred after incubation with the peptide for 15 minutes, as shown by trypan blue uptake, reduction of calcein-AM conversion and LDH release. Morphological studies using scanning electron microscopy demonstrated disruption of the plasma membrane from cells treated with LyeTx I-b, including the formation of holes or pores. Transmission electron microscopy analyses showed swollen nuclei with mild DNA condensation, cell volume increase with an electron-lucent cytoplasm and organelle vacuolization, but without the rupture of nuclear or plasmatic membranes. Morphometric analyses revealed a high percentage of cells in necroptosis stage, followed by necrosis and apoptosis at lower levels. Necrostatin-1, a known inhibitor of necroptosis, partially protected the cells from the toxicity of the peptide in a concentration-dependent manner. Imaging flow cytometry confirmed that, 59% of the cells underwent necroptosis after 3-hour incubation with the peptide. In addition, LyeTx I-b showed cytotoxicity for non-tumor cell lines derived from kidney epithelial cells (Vero), Lung fibroblast (GM637), brain (Luhmes), PBMC and hemolytic activity in human erythrocytes. Additionally, other in vitro data also demonstrated cytotoxicity of this cationic peptide against human and mouse breast cancer cell lines (MCF-7, MDA-MB-231 and 4T1, respectively), at low micro molar concentration (<10 μM). The peptide induced death by apoptosis in 4T1 cells, observed by the increase of DNA fragmentation and annexin-V labeling, besides to reducing the clonogenic survival of this lineage. Considering this finding, all data pointed out the antitumor potential of this peptide, which was evaluated using the 4T1 breast cancer model in mice regarding it toxicity and antineoplastic effect. Sub-acute toxicity of LyeTx I_b peptide in vivo was assessed, and BALB/c mice treated with LyeTx I_b peptide showed no lesion or significant alterations in lung, kidney, spleen, heart, brain, and liver conducted by histopathological analysis. Moreover, LyeTx I-b peptide decreased tumor’s volume and weight, size and number of metastatic foci in the 4T1 tumor-bearing animals. In addition, the peptide reduced the circulating neutrophils, eosinophils and monocytes. By using intravital microscopy, we found a remarkable increase of leukocytes rolling and reduction of leukocytes adhesion after treating with LyeTx I-b peptide into the spinal cord and tumor vessels in 4T1 tumor-bearing animals. Quantification of cytokines and tumor growth factors by ELISA revealed that LyeTx I-b and carboplatin groups showed a significant reduction in TGF-β expression in tumor and spleen, and suppression of IL-1 β in the lung and tumor. Further, LyeTx I-b peptide induced an increase of the anti-inflammatory IL-10 cytokine in the tumor. In summary, our in vivo and in vitro data suggested that LyeTx-I-b peptide could be an interesting prototype to develop an antitumor chemotherapeutic agent, with a potential immunomodulatory effect.
Abstract: Os peptídeos antimicrobianos apresentam um amplo espectro de aplicações terapêuticas, incluindo seu uso como peptídeos anticâncer. Estes peptídeos têm como alvo células microbianas, normais e cancerígenas. Neste trabalho, demonstramos pela primeira vez os efeitos citotóxicos do peptídeo antimicrobiano catiônico alfa-helicoidal, LyeTx I-b, sobre a linhagem de glioblastoma U87-MG, que está associado a um mecanismo membranolítico. A perda de integridade da membrana ocorreu após a incubação com o peptídeo por 15 minutos, observado pela captação de azul de tripan, redução da conversão de calceina-AM e liberação de LDH. Estudos morfológicos utilizando microscopia eletrônica de varredura demonstraram uma rápida ruptura da membrana plasmática de células tratadas com LyeTx I-b, incluindo a formação de orifícios ou poros. Análises por microscopia eletrônica de transmissão mostraram núcleos inchados com leve condensação de DNA, aumento do volume celular com citoplasma eletron-lucente e vacuolização de organelos, mas sem a ruptura de membranas nucleares ou plasmáticas. Análises morfométricas revelaram uma alta porcentagem de células em estágios de necroptose, seguidas de necrose e apoptose em níveis mais baixos. A necrostatina-1, um inibidor especifico de necroptose, protegeu parcialmente as células da toxicidade do péptido de um modo dependente da concentração. Estudos de citometria de fluxo por imagem confirmou que 59% das células tratadas com o peptide estavam em necroptose após 3 horas de incubação com o peptídeo. Ademais, o LyeTx I-b apresentou citotoxicidade para linhagens celulares não tumorais derivadas de rim embrionário humano (HEK293), fibroblasto (GM637), cérebro (Luhmes), PBMC e atividade hemolítica em eritrócitos humanos. Outros dados in vitro também demonstraram a citotoxicidade deste peptídeo catiônico contra linhagens de células de câncer de mama de humanos e camundongos (MCF-7, MDA-MB-231 e 4T1, respectivamente) em baixa concentração micromolar (<10 μM). O peptideo induziu morte por apoptose em células 4T1, observado pelo aumento de fragmentação do DNA e marcação com anexina-V, além de reduzir a sobrevivencia clonogenica das mesmas. Considerando estes achados, avaliou-se o efeito in vivo deste peptídeo utilizando o modelo de câncer de mama triplo-negativo 4T1 em camundongos, quanto à toxicidade e potencial antineoplásico. Avaliou-se a toxicidade sub-aguda do péptido LyeTx I_b in vivo, e os camundongos BALB/c tratados com o péptideo LyeTxI_b não apresentaram lesão ou alterações significativas no pulmão, rim, baço, coração, cérebro e fígado, após análise histopatológica. No entanto, o peptideo LyeTx I-b diminuiu o volume e o peso do tumor, o tamanho e numero de focos metastáticos nos animais portadores de tumor 4T1. Adicionalmente, após tratamento dos animais com o péptideo LyeTx I-b foi observada uma redução significativa de neutrófilos, eosinófilos e monócitos circulantes. Usando microscopia intravital, encontramos um aumento notável de leucócitos rolando e redução da adesão de leucócitos após o tratamento com o peptídeo LyeTx I-b na medula espinhal e vasos tumorais de animais portadores de tumor 4T1. A quantificação de citocinas e dos fatores de crescimento tumoral por ELISA revelaram que os grupos tratados com LyeTx I-b e carboplatina apresentaram uma redução significativa na expressão de TGF-β no tumor e no baço, e supressão de IL-1 β no pulmão e tumor. Além disso, o peptídeo LyeTx I-b induziu um aumento da citocina anti-inflamatória IL-10 no tumor. Em resumo, nossos dados in vitro e in vivo sugerem que o peptídeo LyeTx-I-b pode ser um protótipo interessante para o desenvolvimento de um quimioterápico antitumoral, com um potencial imunomodulador.
Subject: Peptídeos
Glioblastoma
Neoplasias da mama
Necroptose
Imunomodulação
language: por
metadata.dc.publisher.country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Minas Gerais
Publisher Initials: UFMG
metadata.dc.publisher.department: ICB - INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLOGICAS
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-Graduação em Neurociências
Rights: Acesso Aberto
metadata.dc.rights.uri: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/pt/
URI: http://hdl.handle.net/1843/34636
Issue Date: 7-Dec-2018
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