Doença de Sjogren e vírus SARS-CoV-2: aspectos moleculares e imunogênicos relacionados ao SARS-CoV-2 em glândulas salivares
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Tipo
Tese de doutorado
Título alternativo
Sjogren's disease and SARS-CoV-2 vírus: molecular and immunogenic aspects related to SARS-CoV-2 in salivary glands
Primeiro orientador
Membros da banca
Vanessa de Fátima Bernardes
Paula Rocha Moreira
Tatiana Nayara Libório Kimura
Sara Ferreira dos Santos Costa
Paula Rocha Moreira
Tatiana Nayara Libório Kimura
Sara Ferreira dos Santos Costa
Resumo
Com o surgimento da COVID-19, as glândulas salivares foram identificadas como reservatório do SARS-CoV-2. A doença de Sjögren (SjD), uma epitelite autoimune que afeta glândulas exócrinas, incluindo as glândulas salivares, apresenta implicações pouco conhecidas em relação à infecção pelo SARS-CoV-2. Este estudo buscou, portanto, investigar três objetivos, a saber: (i) avaliar a presença do SARS-CoV-2 em biópsias de glândula salivar de pacientes com SjD; (ii) comparar os níveis de expressão gênica tecidual de três fatores relacionados à entrada do SARS-CoV-2 nas células, a saber ACE2, TMPRSS2 e FURIN, em glândulas salivares menores de pacientes com SjD primária (pSjD) em relação às glândulas salivares normais e ao adenoma pleomórfico; (iii) analisar os efeitos da infusão local das proteínas Spike (S) e Envelope (E) do SARS-CoV-2 nas glândulas submandibulares (SMGs) de camundongos C57BL/6. Para responder a esses objetivos, a partir do RNA total extraído das amostras de SjDp e mucocele, a presença de genes do nucleocapsídeo (N1 e N2) do SARS-CoV-2 foi investigada por RT-qPCR em 30 casos de SjD e 98 casos de mucoceles. Os níveis de expressão tecidual dos genes ACE2, TMPRSS2 e FURIN nas glândulas salivares de pacientes com pSjD em relação à glândula salivar normal e ao adenoma pleomórfico foi também avaliada por RT-qPCR. Finalmente, as proteínas S (S1+S2), E ou solução tampão de controle foram injetadas diretamente nas SMGs de camundongos C57BL/6. Os efeitos da infusão foram avaliados por análises histológicas, de citometria de fluxo, imunoistoquímica e ELISA. (i) O vírus foi detectado em 5/128 das amostras analisadas, sendo 4/30 (13,3%) no grupo SjDp e 1/98 (1,0%) do grupo mucocele. (ii) Os níveis de ACE2 estavam suprarregulados na SjDp quando comparado glândula salivar normal e ao adenoma pleomórfico (p = 0,002 and p < 0,001, respectivamente). Os níveis do RNAm de TMPRSS2 e FURIN estavam também elevados na SjDp comparada ao adenoma pleomórfico (p < 0,05). Houve associação entre os níveis de ACE2 e a presença de anti-SSA/SSB na SjDp. Nem ACE2, TMPRSS2 ou FURIN tiveram associação com os casos de SjDp positivos para os genes N1 ou N2 do SARS-CoV-2. (iii) A infusão intra-SMG de proteína S levou à redução significativa na taxa de fluxo salivar (p = 0,003) e a infiltração das SMGs por células imunes em dois terços (4/6) dos camundongos, que não foram afetadas pelo tratamento com o controle e a proteína E. Como resultado, o focus score do grupo tratado com proteína S foi significativamente elevado se comparado ao controle (p = 0,029). A proteína S induziu alterações na ativação das células T CD4+ e B nas SMGs, que foi acompanhado pelo aumento de pSTAT3 em relação ao controle (p < 0,05). Finalmente, a proteína S levou a produção de anticorpos antinucleares na circulação. Em síntese, este estudo sinaliza que há modificações no microambiente da glândula salivar normal ou afetada pela SjD quando avaliado aspectos relacionados ao SARS-CoV-2. Ademais, a proteína S do SARS-CoV-2 desencadeou alterações inflamatórias nas SMGs de camundongos C57BL/6.
Abstract
With the emergence of COVID-19, the salivary glands were identified as a reservoir for
SARS-CoV-2. Sjögren’s disease (SjD), an autoimmune epithelitis affecting exocrine
glands, including the salivary glands, has implications that are not yet well understood
regarding SARS-CoV-2 infection. This study, therefore, aimed to investigate three
objectives, namely: (i) to evaluate the presence of SARS-CoV-2 in salivary gland
biopsies from patients with SjD; (ii) to compare the tissue gene expression levels of
three factors related to SARS-CoV-2 entry into cells, namely ACE2, TMPRSS2, and
FURIN, in minor salivary glands of patients with primary SjD (pSjD) in relation to normal
salivary glands and pleomorphic adenoma; (iii) to analyze the effects of local infusion
of SARS-CoV-2 Spike (S) and Envelope (E) proteins in the submandibular glands
(SMGs) of C57BL/6 mice. To address these objectives, using total RNA extracted from
SjDp and mucocele samples, the presence of SARS-CoV-2 nucleocapsid genes (N1
and N2) was investigated by RT-qPCR in 30 SjD cases and 98 mucocele cases. The
tissue expression levels of ACE2, TMPRSS2, and FURIN genes in the salivary glands
of pSjD patients compared to normal salivary glands and pleomorphic adenoma were
also evaluated by RT-qPCR. Finally, the S (S1+S2), E proteins or a control buffer
solution were injected directly into the SMGs of C57BL/6 mice. The effects of the
infusion were assessed through histological analyses, flow cytometry,
immunohistochemistry, and ELISA. (i) The virus was detected in 5/128 of the analyzed
samples, with 4/30 (13.3%) in the SjDp group and 1/98 (1.0%) in the mucocele group.
(ii) ACE2 levels were upregulated in SjDp compared to normal salivary gland and
pleomorphic adenoma (p = 0.002 and p < 0.001, respectively). TMPRSS2 and FURIN
mRNA levels were also elevated in SjDp compared to pleomorphic adenoma (p <
0.05). There was an association between ACE2 levels and the presence of anti SSA/SSB in SjDp. Neither ACE2, TMPRSS2, nor FURIN were associated with N1 or
N2 SARS-CoV-2 positivity in SjDp cases. (iii) Intra-SMG infusion of S protein led to a
significant reduction in salivary flow rate (p = 0.003) and immune cell infiltration in the
SMGs in two-thirds (4/6) of the mice, which was not observed with control or E protein
treatment. Consequently, the focus score of the S protein-treated group was
significantly elevated compared to the control (p = 0.029). S protein induced changes
in the activation of CD4+ T cells and B cells in the SMGs, accompanied by an increase
in pSTAT3 compared to control (p < 0.05). Finally, S protein led to the production of
antinuclear antibodies in circulation. In summary, this study indicates that there are
changes in the microenvironment of normal or SjD-affected salivary glands when
aspects related to SARS-CoV-2 are evaluated. Additionally, SARS-CoV-2 S protein
triggered significant inflammatory changes in the SMGs of C57BL/6 mice.
Assunto
SARS-CoV-2, Enzima de conversão de angiotensina, Furina, Síndrome de Sjögren, Glândulas salivares
Palavras-chave
SARS-CoV-2, Síndrome de Sjögren, Glândulas salivares, Enzima de conversão de angiotensina 2, TMPRSS2, FURIN