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http://hdl.handle.net/1843/BUOS-8FNGWJ| Type: | Dissertação de Mestrado |
| Title: | Expressão heteróloga e purificação da tityustoxina: obtenção da proteína recombinante Ts3 do escorpião Tityus serrulatus |
| Authors: | Anderson Oliveira do Carmo |
| First Advisor: | Evanguedes Kalapothakis |
| First Referee: | Carlos Delfin Chavez Olortegui |
| Abstract: | O escorpião Tityus serrulatus é a espécie brasileira que possui o veneno mais tóxico e causa elevado número de acidentes, principalmente em áreas urbanas, podendo levar a óbitos crianças e idosos. O tratamento dos casos mais graves consiste em soroterapia, porém este método possui alguns problemas como a obtenção de veneno bruto, manutenção dos cavalos imunizados e baixa sobrevida destes após imunização. Uma alternativa para a solução destes problemas é a expressão heteróloga das principais toxinas em Escherichia coli. Desta maneira, objetivou-se a expressão heteróloga da toxina Ts3 de T. serrulatus sem toxicidade para a produção de soro. A sequência nucleotídica da Ts3 madura foi amplificada e clonada nos vetores de expressão bacteriana pET26b e pET32c. Após a clonagem, os vetores pET26/Ts3 pET32/Ts3e foram expressos em E. coli Origami (DE3), C41 (DE3) e C43 (De3) e a Ts3 recombinante expressada pelo vetor pET26b/Ts3 foi purificada através de uma resina de níquel. Após a purificação, os coelhos foram imunizados com a Ts3 recombinante, após seis doses de Ts3 recombinante foi aplicada uma dose de veneno bruto de T. serrulatus. O soro anti-Ts3 recombinante foi caracterizado por ELISA e SPOT. A Ts3 recombinante não apresentou nenhuma atividade farmacológica em injeção subcutânea em camundongos. O soro anti-Ts3 recombinante apresentou reconhecimento razoável ao veneno bruto por ELISA e o soro anti-Ts3 recombinante com apenas uma dose de veneno obteve aumento de seu reconhecimento. O SPOT revelou maior presença de anticorpos que reconhecem a porção C-terminal desta toxina. O soro anti-Ts3 recombinante não foi capaz de neutralizar o veneno, porém o soro anti-Ts3 recombinante com uma dose de veneno neutralizou 2DL50. O baixo desempenho na neutralização pode estar relacionado a uma conformação inadequada da Ts3 recombinante que não gerou a produção de anticorpos neutralizantes. O uso de toxinas recombinantes na produção de soro necessita de aperfeiçoamento, porém os resultados obtidos mostram que este é um método promissor para a produção de soro antiescorpiônico. |
| Abstract: | The scorpion Tityus serrulatus is a Brazilian species that has the most toxic venom and causes high number of accidents, especially in urban areas, and may lead to deaths in children and the elderly. The treatment of severe cases consists of serum therapy, but this method has some problems, such as obtaining the crude venom, maintenance of horses immunized and poor survival of these animals after such immunization. An alternative to solve these problems is the heterologous expression of the main toxins in Escherichia coli. Thus, the goal of this work was to obtain the heterologous expression of Ts3 toxin of T. serrulatus without toxicity for serum production. The nucleotide sequence of the mature Ts3 was amplified and cloned in bacterial expression vectors pET26b and pET32c. After cloning, the vectors pET26/Ts3 and pET32/Ts3 were expressed in E. coli Origami (DE3), C41 (DE3) and C43 (DE3). Recombinant Ts3 produced by pET26b/Ts3 vector was purified using a nickel resin. After purification, rabbits were immunized with recombinant Ts3. After six boosters of recombinant Ts3, T. serrulatus crude venom was applied in the last booster. The anti-recombinant Ts3 serum was characterized by ELISA and SPOT. Recombinant Ts3 showed no pharmacological activity when injected subcutaneously in mice. The anti-recombinant Ts3 serum showed a reasonable recognition of the crude venom by ELISA and, with only one booster of crude venom, this recognition increased. SPOT revealed increased presence of antibodies that recognize the C-terminal portion of this toxin. Anti-recombinant Ts3 serum was unable to neutralize the venom, but the serum with one booster of crude venom neutralized 2DL50. The low performance in the neutralization may be related to an inadequate conformation of recombinant Ts3 generating poor neutralizing antibodies. The use of recombinant toxins in the serum production needs improvement, but the results show that this is a promising method for the production of anti-venom serum. |
| Subject: | Escorpião Veneno Tityus serrulatus Toxinas Proteínas recombinantes Genética Sorologia |
| language: | Português |
| Publisher: | Universidade Federal de Minas Gerais |
| Publisher Initials: | UFMG |
| Rights: | Acesso Aberto |
| URI: | http://hdl.handle.net/1843/BUOS-8FNGWJ |
| Issue Date: | 16-Feb-2011 |
| Appears in Collections: | Dissertações de Mestrado |
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