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http://hdl.handle.net/1843/BUOS-979FUT
Type: | Dissertação de Mestrado |
Title: | Purificação e caracterização parcial de uma serino-protease tipo tripsina isolada do intestino de larvas de Lutzomyia longipalpis (Diptera, Psychodidae) |
Authors: | Kleber Portela Fortes |
First Advisor: | Nelder de Figueiredo Gontijo |
First Referee: | Marcelo Matos Santoro |
Second Referee: | Mauricio Roberto Viana Sant Anna |
Third Referee: | Vladimir Fazito do Vale |
Abstract: | A Leishmaniose Visceral é uma doença de grande impacto à saúde pública. No Novo Mundo é causada por Leishmania infantum e transmitida principalmente por Lutzomyia longipalpis. Em flebotomíneos adultos, as tripsinas desempenham um importante papel durante o processo de digestão sanguínea, entretanto, pouco se sabe a respeito da ação destas proteases nas formas imaturas. Neste trabalho foi realizado um processo de purificação e caracterização de uma enzima semelhante à tripsina de intestino médio de L. longipalpis. Ensaios enzimáticos na presença de benzamidina (inibidor de tripsina) demonstraram que a atividade tripsinolítica é responsável por maior parte da digestão de proteínas totais (58%) quando comparadas com a atividade quimotripsinolítica (42%). O processo de purificação por cromatografia de afinidade (coluna de p-aminobenzamidina) permitiu a obtenção de frações com atividade tripsinolítica (substrato: L-BApNA), que revelou por SDS-PAGE uma única banda de massa molecular de 20,6 kDa. A análise com benzamidina em SDS-PAGE co-polimerizado com gelatina, bem como ensaios enzimáticos na presença de diversos inibidores indicou que a enzima é uma protease semelhante à tripsina. Ensaios realizados em diferentes faixas de pH demonstraram que a atividade proteolítica máxima ocorre em pH 9,5. A atividade específica encontrada foi de 2511,5 U.mg-1 e o fator de purificação 46,1 vezes. Na determinação cinética, o valor de Km utilizando L-BApNA foi de 0,49 mM. Em análise por espectrometria de massa do material purificado, foi detectada a massa de 23311,88 Da (MALDI-TOF). Com relação ao efeito da concentração de íons metálicos (Ca2+ e Mg2+) e EDTA, verificou-se uma diminuição da atividade tripsinolítica apenas quando EDTA era adicionado aos ensaios em concentrações iguais ou maiores a 18,75 mM, não havendo interferência por parte dos íons metálicos. Este é o primeiro trabalho que relata a purificação e caracterização de uma tripsina digestiva em larvas de L. longipalpis. |
Abstract: | Visceral Leishmaniasis is a disease of major public health impact. In the New World the diasease is caused by Leishmania infantum chagasi and transmitted mainly by Lutzomyia longipalpis. In adult sandflies, trypsins play an important role during of blood digestion. However, little is known about the action of these proteases in immature forms. In this work we purified and characterized a trypsin-like enzyme from the midgut of L. longipalpis. Enzyme assays performed with benzamidine (a trypsin inhibitor) demonstrated that trypsin is responsible for most of total protein digestion (58%) compared with chymotrypsins (42%). The process of purification by affinity chromatography (p-aminobenzamidine column) produced fractions with tryptic activity (substrate: L-BAPNA), which by SDS-PAGE gel analysis revealed a single band of molecular mass of 20.6 kDa. The benzamidine analysis on SDS-PAGE co-polymerized with gelatin and enzyme assays in the presence of various inhibitors indicated that the enzyme is a trypsin-like protease. Assays performed at different pH showed that the maximum tryptic activity occurs at pH 9.5. The specific activity was 2511.5 U.mg-1 and purification factor of 46.1 times. Kinetic analysis using L-BApNA gave a Km value using L-BApNA of 0.49 mM. Mass spectrometry analysis of the purified material detected a mass of 23311.88 Da (MALDI-TOF). Regarding the effects of Ca2+, Mg2+ and EDTA on the trypsin activity, there was a decrease in tryptic activity only when EDTA was added at concentration 18.75 mM, with no interference by metal ions. This is the first study that reports the purification and characterization of a digestive trypsin on L. longipalpis larvae. |
Subject: | Parasitologia |
language: | Português |
Publisher: | Universidade Federal de Minas Gerais |
Publisher Initials: | UFMG |
Rights: | Acesso Aberto |
URI: | http://hdl.handle.net/1843/BUOS-979FUT |
Issue Date: | 28-Feb-2013 |
Appears in Collections: | Dissertações de Mestrado |
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