Produção e uso de proteínas heterólogas quiméricas de flavivírus de circulação nacional para produção de plataformas diagnósticas sorológicas
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Tese de doutorado
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Resumo
Os arbovírus constituem um grupo de vírus transmitidos principalmente por mosquitos. Representam um grande problema de saúde pública em todo o mundo. Dentre eles, destacam-se o vírus da Zika (ZIKV) e o vírus da Dengue (DENV). A dengue é arbovirose mais importante do mundo, sendo associada a uma significativa carga social e financeira, já que anualmente ocorrem surtos dessa doença. A chegada do Zika no Brasil (2015) chamou a atenção, pois apesar de ser uma doença com caráter agudo e autolimitada, parte dos indivíduos apresentaram manifestações neurológicas graves, complicações congênitas e síndrome de Guillain-Barré. A grande semelhança antigênica entre os flavivírus dificultam o diagnóstico diferencial. Assim, destaca-se a necessidade do aprimoramento de ferramentas diagnósticas. O objetivo deste trabalho foi gerar proteínas quiméricas capazes de diferenciar sorologicamente infecções por ZIKV ou DENV. As proteínas recombinantes (ZIKV-1, ZIKV-2, ZIKV-3 e DENV-1) foram desenhadas e seus respectivos genes codificadores foram subclonadas em vetor de expressão pET21a. As proteínas recombinantes foram, então, expressas e purificadas e a sua antigenicidade validada, com exceção de DENV-1, que não foi expressa. As proteínas purificadas foram testadas como antígenos em fase sólida na padronização de protocolos ELISA para detecção de anticorpos anti-ZIKV IgG. Os resultados obtidos após a padronização se mostraram promissores, sendo que os testes elaborados com os antígenos recombinantes apresentaram alta sensibilidade e especificidade, além de baixa reatividade cruzada com o interferente. A proteína ZIKV-1 apresentou 91% de sensibilidade e 97% de especificidade, a proteína ZIKV-2 apresentou 95% de sensibilidade e 96% de especificidade e a proteína ZIKV-3 apresentou 66% de sensibilidade e 84% de especificidade. Em relação ao interferente DENV, houve 10% de reatividade cruzada para ZIKV-1 e 19% para ZIKV-3, ZIKV-2 não apresentou reatividade cruzada. Os ensaios também foram realizados no “Laboratório de Pesquisa em Virologia” (FAMERP) e apresentaram resultados semelhantes, demostrando reprodutibilidade do teste. Os resultados encontrados para ZIKV-1 e ZIKV-2 mostram grande potencial para o desenvolvimento de um teste diagnóstico específico para detecção de anticorpos IgG para ZIKV utilizando as proteínas quiméricas produzidas.
Abstract
Arboviruses constitute a group of viruses transmitted primarily by mosquitoes. They represent
a major public health problem worldwide. Among them, Zika virus (ZIKV) and Dengue virus
(DENV) stand out. Dengue is the most important arboviral disease in the world, being
associated with a significant social and financial burden, outbreaks of this disease occur
annually. The arrival of Zika in Brazil (2015) drew attention, because despite being an acute
and self-limiting disease, part of the individuals had severe neurological manifestations,
congenital complications and Guillain-Barré syndrome. The great antigenic similarity between
flaviviruses makes diagnosis difficult. Thus, there is a need to improve diagnostic tools. The
objective of this work was to generate chimeric proteins capable of serologically differentiating
ZIKV or DENV infections. The recombinant proteins (ZIKV-1, ZIKV-2, ZIKV-3 and DENV-
1) were designed and their respective genes subcloned into a pET21a expression vector. The
recombinant proteins were expressed and purified and antigenicity validated, with the exception
of DENV-1, which did not was expressed. Purified proteins were tested as solid phase antigens
in standard ELISA protocols for detection of anti-ZIKV IgG antibodies. The results obtained
after standardization are promising, and the tests elaborated with the recombinant antigens
showing high sensitivity and specificity, in addition to low cross-reactivity with the interferent.
The ZIKV-1 protein showed 91% sensitivity and 97% specificity, the ZIKV-2 protein showed
95% sensitivity and 96% specificity, and the ZIKV-3 protein showed 66% sensitivity and 84%
specificity. Regarding the DENV interferent, there was 10% cross-reactivity for ZIKV-1 and
19% for ZIKV-3, ZIKV-2 did not show cross-reactivity. The assays were also carried out at the
“Laboratório de Pesquisa em Virologia” (FAMERP) and presented similar results,
demonstrating reproducibility. The results found for ZIKV-1 and ZIKV-2 show great potential
for the development of a specific diagnostic test for the detection of IgG antibodies to ZIKV
using the produced chimeric proteins.
Assunto
Microbiologia, Zika virus, Vírus de Dengue, Teste sorológicos, Ensaio de imunoadsorção enzimática
Palavras-chave
Zika virus, Dengue virus, Diagnóstico sorológico, ELISA