Construção de um vírus recombinante Vaccínia Ankara Modificado (MVA) expressando a Enzima Conversora de Angiotensina 2 (ACE2) humana
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Dissertação de mestrado
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Resumo
Em dezembro de 2019 um novo membro da família Coronaviridae, Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), emergiu na China, e desencadeou um novo tipo de pneumonia viral denominada de doença do coronavírus 2019 (COVID-19). Atualmente a doença é classificada como uma pandemia e é a sexta emergência de saúde pública de interesse internacional já declarada pela Organização Mundial da Saúde. Desse modo, esforços hercúleos têm sido realizados por pesquisadores de todo o mundo para elucidar a infecção e patogênese de SARS-CoV-2 e traçar estratégias de vacinação e terapias antivirais eficazes. O vírus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) é um dos vetores de poxvirus mais bem estudado e mundialmente utilizado para expressão de genes heterólogos. Diante do exposto, o presente trabalho objetivou a construção de um MVA recombinante (rMVA) expressando a enzima conversora de angiotensina II humana (hACE2), proteína utilizada pelo SARS-CoV-2 para infectar as células hospedeiras, para a criação de um modelo de infecção experimental do vírus. Em síntese, culturas de células BHK-21 foram infectadas com MVA selvagem (MVA-WT) e transfectadas com o plasmídeo de transferência contendo o cDNA da ACE2 humana, pLW44-ACE2, gerando através de recombinação homóloga, o vírus recombinante MVA expressando a hACE2 (rMVA-hACE2). Os vírus recombinantes passaram por rodadas de purificação de placa para eleição dos clones de rMVA-hACE2 mais robustos, e eliminação do MVA-WT; para posterior amplificação gradativa do vírus. Paralelamente à técnica de seleção em meio semissólido, foi proposta a utilização da técnica de Cell sorting. A utilização da nova técnica foi efetiva na obtenção de clones, além de permitir uma amplificação mais eficiente e rápida. O vírus recombinante construído teve a expressão da proteína confirmada por citometria de fluxo e posteriormente purificado e titulado. Os dados obtidos sugerem uma reformulação na técnica de produção de MVAs recombinantes e confirmam o sucesso do construto de rMVA- hACE2, tornando-o elegível para a proposta de construção do modelo de infecção experimental para SARS-CoV-2.
Abstract
In December 2019, a new member of the Coronaviridae family, Severe acute
respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), emerged in China, and triggered
a new type of viral pneumonia called coronavirus disease 2019 (COVID-19). The
disease is currently classified as a pandemic and is the sixth public health
emergency of international concern ever declared by the World Health Organization.
Thus, herculean efforts have been undertaken by researchers around the world to
elucidate the infection and pathogenesis of SARS-CoV-2 and to outline effective
vaccination strategies and antiviral therapies. Modified Vaccinia Ankara virus (MVA)
is one of the best-studied poxvirus vectors used worldwide for expression of
heterologous genes. In view of the above, the present work aimed at the construction
of a recombinant MVA (rMVA) expressing the human angiotensin II converting
enzyme (hACE2), a protein used by SARS-CoV-2 to infect host cells, for the creation
of a model of experimental virus infection. In summary, cultures of BHK-21 cells were
infected with wild-type MVA (MVA-WT) and transfected with the transfer plasmid
containing the human ACE2 cDNA, pLW44-ACE2, generating through homologous
recombination, the recombinant MVA virus expressing hACE2 (rMVA-hACE2).
Recombinant viruses underwent rounds of plaque purification to choose the most
robust rMVA-hACE2 clones and eliminate MVA-WT; for further gradual amplification
of the virus. Parallel to the selection technique in semi-solid medium, the use of the
Cell sorting technique was proposed. The use of the new technique was effective in
obtaining clones, in addition to allowing a more efficient and faster amplification. The
constructed recombinant virus had protein expression confirmed by flow cytometry
and subsequently purified and titrated. The data obtained suggest a reformulation of
the technique for producing recombinant MVAs and confirm the success of the
rMVA-hACE2 construct, making it eligible for the proposed construction of an
experimental infection model for SARS-CoV-2.
Assunto
Microbiologia, Covid-19, Vírus da SARS, Peptidil dipeptidase A, Vírus vaccinia
Palavras-chave
SARS-CoV-2, ACE2, modelo animal, poxvírus, vetores recombinantes