Peptídeo natriurético tipo C no líquido folicular humano: relação com a maturação oocitária
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Dissertação de mestrado
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Resumo
O peptídeo natriurético tipo-C (CNP) é um produto das células da granulosa (GC) que
se liga a seu receptor transmembrana (receptor de peptídeos natriuréticos tipo 2,
NPR2) e sinaliza através do segundo mensageiro monofosfato de guanidina cíclico
(cGMP). Estudos em camundongos demonstraram que a sinalização do CNP contribui
para o crescimento folicular ovariano e para a parada meiótica oocitária até o momento
do pico pré-ovulatório do hormônio luteinizante (LH). Em humanos, por outro lado, a
relação entre os níveis de CNP folicular e a retomada meiótica dos oócitos ainda é
desconhecida. O objetivo deste estudo foi investigar se os níveis do CNP e do seu
receptor no ovário variam de acordo com o estágio de maturação dos oócitos humanos.
Coletamos fluido folicular (FF) e GC murais em pool de diversos folículos de 47
pacientes, e também FF, GC murais e CC de 96 folículos pré-ovulatórios individuais de
outras 39 pacientes submetidas a estimulação ovariana controlada (COS) para
tratamento de fertilização in vitro (IVF). O estágio de maturação de cada oócito
coletado oriundo de folículo puncionado individualmente foi avaliado após denudação
para injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Os níveis de CNP foram
avaliados no FF por ensaio imunoenzimático (EIA). Os mRNAs codificadores do
precursos do CNP (NPPC) e do seu receptor NPR2 foram quantificados por reversetranscriptase real-time PCR (RT-PCR). Foi encontrada uma correlação positiva entre os
níveis de CNP no pool de FF com a contagem de folículos antrais (AFC, rs=0,458
p=0,002), de folículos pré-ovulatórios >16mm (rs=0,361; p=0,016) e de oócitos
coletados (rs=0,378; p=0,01) e uma correlação negativa entre os níveis de CNP no pool de FF e a porcentagem de oócitos maduros metáfase II, MII) coletados (rs=-0,39;
p=0,033). Os níveis de CNP no FF de folículos com oócitos MII foram
consideravelmente menores que de folículos contendo oócitos imaturos (metáfase I,
MI) (mediana=0,44 vs 0,57 ng/mL, p<0,05). Em concordância, a expressão gênica de
NPPC foi diminuída em 50% nas GC de folículos contendo oócitos MII quando
comparada aos folículos contendo oócitos MI (p<0.01). A expressão gênica de NPR2 é
diminuída nas CC oriundas de oócitos MII quando comparada à expressão em CC
oriundas de oócitos MI (redução de 60%, p<0.01). Foi detectado mRNA do receptor de
LH (LHR) tanto em CC quanto em GC de folículos contendo oócitos MII e contendo
oócitos MI, sendo quatro vezes mais abundante nas CC que nas GC. Concluímos que
a sinalização do CNP é diminuída nos folículos ovarianos contendo oócitos maduros.
Entretanto, mais estudos in vitro são necessários para esclarecermos se a sinalização
do CNP é essencial na manutenção da parada meiótica oocitária em humanos.
Abstract
C-type natriuretic peptide (CNP) is a product of granulosa cells (GC) that binds to a
transmembrane receptor (natriuretic peptide receptor type 2, NPR2) and signals
through the second messenger cyclic guanosine monophosphate (cGMP). Studies in
mice have shown that CNP signaling contributes to ovarian follicle growth and oocyte
meiotic arrest until the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge. In humans,
however, the relationship between follicular CNP levels and oocyte meiotic resumption
is still unknown. The aim of this study was to investigate whether ovarian CNP levels
and NPR2 expression change according to the meiotic phase of human oocytes. We
collected follicular fluid (FF) and mural GC in pool from several follicles (n=47
participants), and FF, mural GC and CC from 96 preovulatory follicles (n=39
participants) of women undergoing controlled ovarian stimulation (COS) for in vitro
fertilization (IVFI). We kept track of the maturation stage of each oocyte from follicles
assessed individually at the time of oocyte denudation. CNP levels were measured in
the FF by enzyme immunoassay. The mRNAs encoding for the CNP precursor NPPC
and its receptor NPR2 were quantified by reverse-transcription real-time PCR (RTPCR). There was a positive linear correlation between CNP levels in FF pools and basal
antral follicle counting (rs=0,458; p=0,002), number of preovulatory follicles >16 mm
(rs=0,361; p=0,016) and number of oocytes retrieved (rs=0,378; p=0,011) and a negative
correlation between CNP levels in FF pools and the percentage of mature (metaphase
II, MII) oocytes retrieved (rs=-0,39; p=0,033). FF CNP levels in follicles containing MII
oocytes were considerably lower than in follicles containing immature (metaphase I, MI) oocytes (median = 0.44 vs. 0.57 ng/ml, p < 0.05). Accordingly, NPPC gene expression
was reduced by 50% in the GC from follicles containing MII oocytes when compared to
GC from follicles containing MI oocytes (p<0.01). In addition, NPR2 mRNA was downregulated in CC surrounding MII oocytes compared to CC from MI oocytes (60%
reduction, p<0.01). LH receptor mRNA expression was detected in both CC and GC of
follicles containing MII or MI oocytes, being four-fold more abundant in CC than in GC.
CNP signaling is downregulated in human ovarian follicles containing mature oocytes.
Further in vitro studies should clarify whether CNP signaling is essential to keep oocyte
meiotic arrest in humans.
Assunto
Peptídeo Natriurético Tipo C, Técnicas de Maturação in Vitro de Oócitos, Fertilização In Vitro
Palavras-chave
CNP, NPR2, Maturação oocitária, Fertilização in vitro