Perfil mitocondrial de eosinófilos no contexto da ativação celular e doenças eosinofílicas
Carregando...
Data
Autor(es)
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
Descrição
Tipo
Tese de doutorado
Título alternativo
Primeiro orientador
Membros da banca
Resumo
O papel desempenhado pelas mitocôndrias nas células do sistema imunológico tem chamado cada vez mais a atenção. As mitocôndrias são vistas como mediadoras das funções imunológicas e da inflamação e estão associadas a diversos processos biológicos, como a secreção de citocinas. No entanto, nossa compreensão atual da atividade, arquitetura e alterações morfológicas em mitocôndrias de eosinófilos sob condições patológicas ainda é pouco conhecida. Aqui, nos investigamos a atividade, permeabilidade e ultraestrutura de mitcôndrias em esoinófilos humanos em resposta a estímulos por citocinas pró-inflamatórias [fator de necrose tumoral alfa (TNF-α); ligante C-C da Quimiocina 5 (CCL-5) ligante C-C da Quimiocina 11 (CCL-11)] e no contexto de doenças inflamatórias intestinais e doenças respiratórias [doença de Crohn (DC); retocolite ulcerativa (RCU) e rinosinusite eosinofílica (RCE)], que são caracterizadas pelo recrutamento e ativação de eosinófilos. A análise foi obtida de eosinófilos isolados do sangue periférico humano de doadores saudáveis estimulados com TNF-α, CCL-5, CCLL-11 e analisados com ensaio para os marcadores MitoTracker e MitoSox por citometria de fluxo. Paralelamente, eosinófilos sanguíneos e amostras de biópsia intestinal e do sinus de pacientes com DC, RCU e RCE foram preparados para microscopia eletrônica de transmissão (MET). Eosinófilos teciduais detectados em locais inflamatórios mostrando perfil celular completo, núcleo e membrana plasmática intacta foram investigados Um total de 84 eosinófilos e 1056
mitocôndrias foram quantificados e os seguintes aspectos mitocondriais foram avaliados: i) Área total mitocondrial, número e tamanho individual; ii) Volume das cristas mitocondriais; iii) Padrão das cristas mitocondriais; e iv) Interações mitocondria-outras organelares representadas por sítios de contato de membrana ou “theter”. Todas as análises quantitativas foram realizadas utilizando o software Fiji. Observamos que a atividade mitocondrial e a permeabilidade de eosinófilos estimulados por TNF-α, CCL-5 e CCL11 aumentaram significativamente em comparação às células controle. As características ultraestruturais de eosinófilos ativados foram observadas em todos os grupos experimentais em paralelo a mudanças significativas na área total mitocondrial, número, tamanho único, volume
das cristas e padrões de cristas representados por diferentes morfologias (lamelar, tubular e mista). Nossas descobertas demonstraram que eosinófilos humanos sofrem remodelação das cristas mitocondriais após estimulação in vitro e durante doenças
inflamatórias. Além disso, o número de interações interorganelares aumentou durante todas as condições inflamatórias, com interações mitocondriais significativas estabelecidas com retículo endoplasmático (RE), outras mitocôndrias, grânulos
secretores, corpúsculos lipídicos (CLs) e vesículas sombrero de eosinófilos (EoSVs). Por fim, identificamos que o padrão de interações mitocondriais mudou de acordo com o microambiente, com sítios de contato mitocôndrias-EoSVs e mitocôndrias-CL detectados apenas em eosinófilos ativados. Em conjunto, nossos achados identificaram que a remodelação e as interações entre mitocôndrias e organelas estão intimamente associadas à ativação de eosinófilos induzida por inflamação e à imunomodulação de suas respostas durante doenças inflamatórias. Esses eventos demonstram que as mitocôndrias dentro dos eosinófilos respondem ao ambiente circundante e podem participar de vias de sinalização que regulam as funções imunológicas dos eosinófilos
Abstract
The roles played by mitochondria in cells of the immune system has increasingly
drawing attention. Mitochondria mediating immune functions and inflammation have
been associated with diverse biological processes such as cytokine secretion.
However, our current understanding of the mitochondrial activity, architecture and
morphological changes in eosinophils under pathological conditions is still poorly
known. Here, we investigated the activity, permeability, and ultrastructure of
mitochondria within human eosinophils in response to a pro-inflammatory cytokine
stimulation [tumor necrosis factor-alpha (TNF-α); C-C motif chemokine ligand 5 (CCL-
5); C-C motif chemokine ligand 11 (CCL-11)], and in the context of inflammatory bowel
diseases (IBD) and respiratory diseases [Crohn’s disease (CD); ulcerative colitis (UC)
and eosinophilic rinosinusitis (ERS)], which are characterized by recruitment and
activation of eosinophils. Analysis was obtained from eosinophils isolated the human
peripheral blood from healthy donors stimulated with TNF-α, CCL-5, CCLL-11 and
analyzed with MitoTracker and MitoSox assays by flow cytometry. In parallel, blood
eosinophils and intestinal and sinus biopsy samples from patients with IBDs and ERS
were prepared for transmission electron microscopy (TEM). Tissue eosinophils
detected in inflammatory sites showing the entire cell profile, nucleus and intact plasma
membrane were investigated with single cell imaging analysis. A total of X eosinophils
and X mitochondria were counted and the following mitochondrial aspects were
evaluated: i) Mitochondrial total área, number and sigle size; ii) Mitochondrial cristae
volume; iii) Mitochondrial cristae pattern; and iv) Mitochondrial-organellar interactions
represented by membrane contact sites or tethers. All quantitative analyses were
performed using Fiji software. We observed that mitochondrial activity and permeability
of TNF-α, CCL-5 and CCL11-stimulated eosinophils significantly increased compared
to control cells. The ultrastructural signatures of activated eosinophils were observed
in all experimental groups in parallel to significant changes in mitochondrial total área,
numeber, single size, cristae volume and cristae patterns represented by different
morphologies (lamellar, tubular, and mixed) Our findings demonstrated that human
eosinophils undergo mitochondrial cristae reshaping after both in vitro stimulation and
during inflammatory diseases . Furthermore, the number of inter-organelle interactions
increased during all inflammatory conditions, with significant mitochondrial interactions
established with endoplasmic reticulum (ER), other mitochondria, secretory granules,
lipid droplets (LDs), and eosinophils sombrero vesicles (EoSVs). Finally, we identified
that the pattern of mitochondrial interactions changed according to the
microenvironment, with mitochondria-EoSVs and mitochondria-LD contact sites
detected only in activated eosinophils. Altogether, our findings identified that
mitochondrial remodeling and mitochondria inter-organelle interactions are closely
associated with inflammation-induced eosinophil activation and immunomodulation of
their responses during inflammatory diseases. These events demonstrate that
mitochondria within eosinophils are responsive to the surrounding milieu and may
participate in signaling pathways that regulate eosinophil immune functions.
Assunto
Biologia celular, Mitrocôndrias, Citocinas, Eosinófilo, Inflamação
Palavras-chave
eosinófilo, mitocôndrias, citocinas, doenças eosinofílicas, microscopia eletrônica, citometria de fluxo, inflamação