Exploring the Potential of CRISPR-Cas9 Under Challenging Conditions: facing high-copy plasmids and counteracting beta-lactam resistance in clinical strains of enterobacteriaceae
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Explorando o potencial do CRISPR-Cas9 em condições desafiadoras: enfrentando plasmídeos de alta cópia e combatendo a resistência a beta-lactâmicos em cepas clínicas de enterobacteriaceae
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Resumo
The antimicrobial resistance (AMR) crisis urgently requires countermeasures for reducing the dissemination of plasmid-borne resistance genes. Of particular concern are opportunistic pathogens of Enterobacteriaceae. One innovative approach is the CRISPR-Cas9 system which has recently been used for plasmid curing in defined strains of Escherichia coli. Here we exploited this system further under challenging conditions: by targeting the blaTEM–1 AMR gene located on a high-copy plasmid (i.e., 100–300 copies/cell) and by directly tackling blaTEM–1-positive clinical isolates. Upon CRISPR-Cas9 insertion into a model strain of E. coli harboring blaTEM–1 on the plasmid pSB1A2, the plasmid number and, accordingly, the blaTEM–1 gene expression decreased but did not become extinct in a subpopulation of CRISPR-Cas9 treated bacteria. Sequence alterations in blaTEM–1 were observed, likely resulting in a dysfunction of the gene product. As a consequence, a full reversal to an antibiotic sensitive phenotype was achieved, despite plasmid maintenance. In a clinical isolate of E. coli, plasmid clearance and simultaneous re-sensitization to five beta-lactams was possible. Reusability of antibiotics could be confirmed by rescuing larvae of Galleria mellonella infected with CRISPR-Cas9-treated E. coli, as opposed to infection with the unmodified clinical isolate. The drug sensitivity levels could also be increased in a clinical isolate of Enterobacter hormaechei and to a lesser extent in Klebsiella variicola, both of which harbored additional resistance genes affecting beta-lactams. The data show that targeting drug resistance genes is encouraging even when facing high-copy plasmids. In clinical isolates, the simultaneous interference with multiple genes mediating overlapping drug resistance might be the clue for successful phenotype reversal.
Abstract
A crise da resistência antimicrobiana (RAM) exige urgentemente contramedidas para reduzir a disseminação de genes de resistência presentes em plasmídeos. Patógenos oportunistas da família Enterobacteriaceae são particularmente preocupantes . Uma abordagem inovadora é o sistema CRISPR-Cas9, que foi recentemente utilizado para a eliminação de plasmídeos em cepas específicas de Escherichia coli . Neste estudo, exploramos ainda mais esse sistema em condições desafiadoras: direcionando o gene de RAM blaTEM - 1 localizado em um plasmídeo de alta cópia (ou seja, 100-300 cópias/célula) e combatendo diretamente isolados clínicos positivos para blaTEM - 1 . Após a inserção do CRISPR-Cas9 em uma cepa modelo de E. coli portadora do gene blaTEM - 1 no plasmídeo pSB1A2, o número de plasmídeos e, consequentemente, a expressão do gene blaTEM - 1 diminuíram, mas não foram completamente eliminados em uma subpopulação de bactérias tratadas com CRISPR-Cas9. Foram observadas alterações na sequência do gene blaTEM - 1 , provavelmente resultando em disfunção do produto gênico. Como consequência, foi obtida a reversão completa para um fenótipo sensível a antibióticos, apesar da manutenção do plasmídeo. Em um isolado clínico de *E. coli* , foi possível a eliminação do plasmídeo e a ressensibilização simultânea a cinco beta-lactâmicos. A reutilização dos antibióticos pôde ser confirmada pelo resgate de larvas de * Galleria mellonella* infectadas com *E. coli* tratada com CRISPR-Cas9 , em contraste com a infecção pelo isolado clínico não modificado. Os níveis de sensibilidade aos fármacos também puderam ser aumentados em um isolado clínico de *Enterobacter hormaechei* e, em menor grau, em *Klebsiella variicola* , ambos portadores de genes de resistência adicionais que afetam os beta-lactâmicos. Os dados demonstram que o direcionamento de genes de resistência a fármacos é promissor mesmo diante de plasmídeos de alta cópia. Em isolados clínicos, a interferência simultânea com múltiplos genes que medeiam resistência a fármacos sobrepostos pode ser a chave para a reversão fenotípica bem-sucedida.
Assunto
Resistência microbiana a medicamentos, Enterobacteriaceae, Sistemas CRISPR-Cas
Palavras-chave
CRISPR-Cas9, Antimicrobial resistance, BlaTEM, Re-sensitization, Resistance reduction, Plasmid maintenance
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https://www.frontiersin.org/journals/microbiology/articles/10.3389/fmicb.2020.00578/full