Exploring the Potential of CRISPR-Cas9 Under Challenging Conditions: facing high-copy plasmids and counteracting beta-lactam resistance in clinical strains of enterobacteriaceae

Abstract

A crise da resistência antimicrobiana (RAM) exige urgentemente contramedidas para reduzir a disseminação de genes de resistência presentes em plasmídeos. Patógenos oportunistas da família Enterobacteriaceae são particularmente preocupantes . Uma abordagem inovadora é o sistema CRISPR-Cas9, que foi recentemente utilizado para a eliminação de plasmídeos em cepas específicas de Escherichia coli . Neste estudo, exploramos ainda mais esse sistema em condições desafiadoras: direcionando o gene de RAM blaTEM - 1 localizado em um plasmídeo de alta cópia (ou seja, 100-300 cópias/célula) e combatendo diretamente isolados clínicos positivos para blaTEM - 1 . Após a inserção do CRISPR-Cas9 em uma cepa modelo de E. coli portadora do gene blaTEM - 1 no plasmídeo pSB1A2, o número de plasmídeos e, consequentemente, a expressão do gene blaTEM - 1 diminuíram, mas não foram completamente eliminados em uma subpopulação de bactérias tratadas com CRISPR-Cas9. Foram observadas alterações na sequência do gene blaTEM - 1 , provavelmente resultando em disfunção do produto gênico. Como consequência, foi obtida a reversão completa para um fenótipo sensível a antibióticos, apesar da manutenção do plasmídeo. Em um isolado clínico de *E. coli* , foi possível a eliminação do plasmídeo e a ressensibilização simultânea a cinco beta-lactâmicos. A reutilização dos antibióticos pôde ser confirmada pelo resgate de larvas de * Galleria mellonella* infectadas com *E. coli* tratada com CRISPR-Cas9 , em contraste com a infecção pelo isolado clínico não modificado. Os níveis de sensibilidade aos fármacos também puderam ser aumentados em um isolado clínico de *Enterobacter hormaechei* e, em menor grau, em *Klebsiella variicola* , ambos portadores de genes de resistência adicionais que afetam os beta-lactâmicos. Os dados demonstram que o direcionamento de genes de resistência a fármacos é promissor mesmo diante de plasmídeos de alta cópia. Em isolados clínicos, a interferência simultânea com múltiplos genes que medeiam resistência a fármacos sobrepostos pode ser a chave para a reversão fenotípica bem-sucedida.