Investigation of Leptospira biofilms through environmental and laboratorial study

Abstract

Biofilmes são complexos micro-ecossistemas compostos por microrganismos inseridos em uma matriz exopolimérica autoproduzida. Biofilmes são reconhecidos por sua importância ecológica e capacidade de abrigar uma diversidade de microrganismos patogênicos e não patogênicos, protegendo-os contra desafios ambientais. Leptospiras são bactérias espiroquetas ubíquas, formadoras de biofilme e que possuem exigências nutricionais elevadas. Leptospiras patogênicas formam biofilmes em arrozais rurais e nos túbulos renais de Rattus norvegicus naturalmente infectados, um importante hospedeiro de Leptospira em ambientes urbanos. A leptospirose possui um ciclo epidemiológico complexo, com uma fase ambiental relacionada a águas e solos, e inúmeros hospedeiros animais. No entanto, os mecanismos de sobrevivência de leptospiras no ambiente são muito mal compreendidos. Nossa hipótese é que biofilmes ambientais podem abrigar Leptospira, servindo como um nicho ecológico para essas bactérias. Utilizando abordagens multidisciplinares, coletamos biofilmes ambientais formados em um ambiente urbano brasileiro com condições de saneamento precárias e realizamos análises laboratoriais, genômicas e bioinformáticas. A partir dos biofilmes coletados, isolamos e identificamos 20 cepas de Leptospira, classificadas em sete espécies do clado “Saprofítico” S1. Três delas são propostas como novas espécies com base na hibridização digital DNA-DNA (dDDH) e identidade média de nucleotídeos (ANI). Essas espécies apresentaram crescimento e morfologia típicos e formaram biofilmes in vitro. Além disso, nossa pesquisa teve como objetivo explorar o crescimento e a formação de biofilmes por Leptospira biflexa em meio Hornsby-Alt-Nally (HAN), um meio rico utilizado para o isolamento e propagação de leptospiras que foi recentemente desenvolvido. Leptospiras foram propagadas em meio HAN a 29°C e 37°C com 5% de CO2. L. biflexa planctônicas cresceram de maneira semelhante em ambas as condições, apresentando comprimentos celulares maiores a 37°C / 5% CO2, condição em que a formação de biofilme foi maior de acordo com a quantificação do cristal violeta. Nas condições testadas, as proteínas tiveram maior biomassa que DNA de fita dupla (células vivas e mortas e DNA extracelular) na matriz do biofilme. Observou-se a formação de uma camada distinta de proteínas na base do biofilme, aderida ao substrato. Por fim, a eletroforese em gel unidimensional sugere uma expressão diferencial de proteínas entre as condições testadas. Nesse trabalho, demonstramos uma diversidade de espécies saprófitas de Leptospira sobrevivendo no ambiente urbano precariamente saneado do Brasil, adotando um estilo de vida em biofilme. O entendimento do modo de sobrevivência de Leptospira no ambiente pode preencher lacunas na compreensão do ciclo de transmissão da leptospirose. Acreditamos que a sobrevivência dessas espiroquetas no ambiente está relacionada à formação de biofilmes, uma característica deste gênero. Também observamos que L. biflexa cultivada em meio HAN forma biofilmes em diferentes temperaturas, aumentando sua formação a 37°C com 5% de CO2. Além disso, nossos resultados indicam que as proteínas podem desempenhar um papel nas etapas de adesão do biofilme. Nossos resultados enriquecem a compreensão da biologia e ecologia de leptospiras, em condições laboratoriais e ambientais, destacando o papel dos biofilmes como reservatórios naturais para essas bactérias.