Enhancing biocatalitic performance of the enzyme (S)-norcoclaurine synthase: adsorption immobilization on low-cost supports for stereoselective Pictet-Spengler reaction

Abstract

A enzima (S)-norcoclaurina sintase ((S)-NCS) catalisa a reação de Pictet–Spengler de forma estereosseletiva entre dopamina e compostos carbonílicos, viabilizando a síntese sustentável de alcaloides tetraidroisoquinolínicos (THIQs) com relevância farmacêutica. No entanto, sua baixa estabilidade operacional e falta de reutilização limitam sua aplicação em escala industrial. Neste estudo, investigou-se a imobilização da (S)-NCS por adsorção em diferentes materiais, com ênfase nos suportes inorgânicos de baixo custo Caolin e Celite 545, como estratégia para aprimorar seu desempenho biocatalítico. A variante recombinante Δ19TfNCS foi expressa heterologamente em E. coli, purificada e imobilizada via adsorção física. Inicialmente, diversos materiais foram triados para identificar os mais adequados à catálise da reação de Pictet–Spengler entre dopamina e hexanal. A imobilização de Δ19TfNCS nos materiais selecionados (Caolin e Celite 545) foi aprofundada, resultando na definição de um protocolo definitivo de imobilização. Os biocatalisadores obtidos foram então avaliados quanto à atividade catalítica, estabilidade térmica, tolerância a co-solventes orgânicos e reutilização. Notavelmente, ambos os suportes melhoraram a estabilidade térmica e operacional da enzima, mas o Caolin apresentou desempenho superior. O material atingiu maiores rendimentos de imobilização, mantendo eficiência de adsorção acima de 85% mesmo em concentrações enzimáticas de até 7,5 mg/mL. Em contraste, o rendimento da Celite 545 caiu de 76 ± 2% para 60 ± 3% com o aumento da razão enzima/suporte. Essa capacidade de adsorção aprimorada é atribuída à maior área superficial específica do Caolin (11,063 m²/g vs. 0,756 m²/g) e ao potencial zeta mais negativo (−36,3 mV vs. −15,4 mV), que favorecem interações eletrostáticas mais fortes com a região N-terminal positivamente carregada da Δ19TfNCS. Além disso, a enzima imobilizada em Caolin reteve maior atividade catalítica na presença de altas concentrações de DMSO, enquanto os catalisadores à base de Celite apresentaram perda significativa de atividade, destacando a maior capacidade do Caolin de proteger a enzima contra a desnaturação induzida por solventes.Simulações de Monte Carlo foram empregadas para fornecer informações em nível molecular sobre o processo de adsorção no Caolin, sugerindo orientações preferenciais da enzima e interações-chave entre aminoácidos e a superfície. As simulações indicaram o papel fundamental dos resíduos de histidina positivamente carregados na região N-terminal desestruturada da Δ19TfNCS na forte afinidade eletrostática com a superfície do Caolin.