Estudo do potencial biotecnológico da proteína SmKI-1 do Schistosoma mansoni: aplicabilidade de seu domínio Kunitz como uma molécula anti-inflamatória e de seu domínio C-terminal como candidato à uma vacina anti-esquistossomótica
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Tipo
Tese de doutorado
Título alternativo
Primeiro orientador
Membros da banca
Vasco Ariston de Carvalho Azevedo
Rafael Pinto Vieira
Luciana Cezar de Cerqueira Leite
Bárbara de Castro Pimentel Figueiredo
Rafael Pinto Vieira
Luciana Cezar de Cerqueira Leite
Bárbara de Castro Pimentel Figueiredo
Resumo
A proteína SmKI-1 do Schistosoma mansoni está intrinsecamente associada à sua sobrevivência; e apresenta um inibidor ubíquo de serino proteases do tipo Kunitz e uma domínio C-terminal desordenado e sem homólogos fora do gênero. O domínio Kunitz (KD) apresenta papel essencial no bloqueio da ligação com a elastase neutrofílica (HNE), no comprometimento da migração/ativação de neutrófilos, além de exibir elevado potencial anti-inflamatório. Este domínio apresenta em seu sítio ativo (P1) um resíduo de arginina (Arg18), sendo esta uma região central para a atividade inibidora da HNE. Neste estudo, foram realizadas análises estruturais in silico desta proteína visando sua produção para estudos de inibição enzimática da HNE e ensaios vacinais. Desenvolvemos um protocolo de expressão onde o KD foi clonado ao plasmídeo pET-32a junto à uma proteína de fusão (TRX) e recuperado de forma solúvel. Por meio de análises biofísicas, a estabilidade e o padrão de estruturação da proteína foram verificados. Análises in silico por modelagem e ancoragem molecular nos permitiram o desenho de duas mutações sítio-dirigidas com o objetivo de melhorar a atividade inibitória da HNE: (1) a substituição da Arg18 no sítio P1 por um resíduo de leucina e (2) a substituição do Glu14 por um resíduo de alanina (mutações RL-KD e EA-KD, respectivamente). Essas substituições basearam-se na preferência da HNE por resíduos hidrofóbicos como a leucina na posição P1, de inibidores reportados em bancos de dados, e em nossas análises estruturais, que também demonstraram que a substituição do Glu14 contribuiria para uma alteração na dinâmica conformacional do sítio P1 de modo a a facilitar o complexo com a HNE. As proteínas mutantes foram produzidas solúveis e funcionais e utilizadas em ensaios de inibição enzimática in vitro para HNE, demonstrando atividade inibitória melhorada quando comparadas ao KD. A variante RL-KD apresentou melhor performance nos ensaios de inbição in vitro e, portanto, foi avaliada quanto ao seu potencial anti-inflamatório em um modelo in vivo de artrite gotosa aguda induzida por cristais de MSU. Apesar da diminuição da sensação dolorosa pelos animais e redução dos parâmetros inflamatórios testados, não foi observada diferença estatística quando comparado ao KD. Paralelamente, avaliamos de forma individual a SmKI-1 e seus domínios estruturais em formulações vacinais em modelo murino. Observamos que a SmKI-1 induziu 46,7% de proteção e o domínio C-terminal 27,8% na redução do número de vermes; enquanto, o domínio KD não foi capaz de proteger contra à infecção. Este trabalho demonstra o potencial dos domínios da SmKI-1, o KD para o desenho racional de uma molécula anti-inflamatória e a região C-terminal como candidato à vacina contra à esquistossomose.
Abstract
Assunto
Genética, Schistosoma mansoni, Vacinas, Biotecnologia, Elastase de leucócito
Palavras-chave
SmKI-1, Kunitz, Elastase, Vacina, Biotecnologia, Esquistossomose